[发明专利]一种基于RPA技术检测爪哇根结线虫的引物和探针

说明书

本发明的目的是提供1套利用RPA快速技术检测爪哇根结线的引物、探针及方法，其中1对引物序列如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示，探针序列如SEQ ID No:7所示。利用本发明的引物和探针进行RPA反应后检测爪哇根结线虫，不仅快速、简便、易操作，检测结果可视化，而且可以摆脱对PCR仪等精密仪器和专业技术背景的依赖，本发明在爪哇根结线虫的田间快速诊断、病原鉴定方面广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一套利用重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase plolymerase amplification，RPA)结合侧向试流试纸条(Lateral flowstrips)检测爪哇根结线虫的引物、探针及方法。

背景技术

爪哇根结线虫(Meloidogyne.javanica)是危害最严重的根结线虫之一，在我国的广东、海南、广西、云南等地分布较广。根结线虫的寄主范围很广，可寄生蔬菜、中草药、果树等2000多种植物。线虫寄生植物根系，在植物根系形成巨大的根结，不仅掠夺植物营养，影响植物正常发育，而且容易引起其他根部病害的复合侵染。

传统上根结线虫的检测和鉴定主要基于形态学、同工酶技术以及PCR技术，这些技术对操作人员的专业素质要求高，需要高级显微镜、PCR仪等昂贵仪器，且耗时长，难以应用于田间快速诊断。RPA(Recombinase Polymerase Amplifcation) 是一项利用重组酶聚合酶等温扩增的技术，该技术可以在37℃至42℃的恒温条件下，利用1对引物在算时间内实现核酸靶标片段的快速扩增，结合侧向试纸条检测，可以无需任何精密仪器，实现核酸的扩增和结果的可视化检测，相比另一种环等温扩增扩增技术LAMP，其反应时间更短，反应温度低，且扩增后产生单一目的条带，具有十分广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用RPA技术检测爪哇根结线虫的特异性引物、探针及方法，不依赖精密的科学仪器和专业技术背景，实现对爪哇根结线虫的快速可视化检测。

本发明提供的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No:3所示，反向引物如SEQID No:4所示，探针序列如SEQ ID No:7所示。

所述反向引物的5’端标记生物素Biotin基团；所述探针5’端标记荧光素 FAM基团，第33位的鸟嘌呤被替换为dSpacer，3’端添加C3Spacer。

本发明还提供了一种利用重组酶聚合酶等温扩增技术结合侧向试纸条检测技术快速检测爪哇根结线虫的方法：RPA反应使用nfo kit，反应总体系为50μL，首先在0.2ml的PCR管中加入缓冲液29.5μL，10μM的上下游引物各2.1μL，10μM的探针0.6μL，DNA模板1μL，ddH₂O 12.2μL，混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的反应管中混匀，加入280mM的MgAc溶液2.5μL，将反应管置于金属浴中，38℃反应30分钟，反应产物使用侧向流试纸条进行检测。

本发明根据通过比对不同根结线虫基因组序列设计并筛选出一套利用RPA 特异性检测爪哇根结线虫的引物和探针，利用该引物和探针，以爪哇根结线虫 DNA为模板进行反应，反应产物使用侧向流试纸条检测，阳性指示带显色；利用本发明提供的方法，检测其他线虫DNA，阳性指示条带不显色，表明本发明提供的RPA检测方法特异性高；同时，本发明提供的RPA检测的灵敏度为 10pg/μL。

附图说明

图1为爪哇根结线虫RPA检测引物和探针的设计和筛选

A为引物的筛选，M：DL2000 DNA Marker；1-3：引物MJ1RPAF/MJ1RPAR， MJ2RPAF/MJ2RPAR，MJ3RPAF/MJ3RPAR扩增结果。

B为加入探针后使用侧向流试纸条检测结果。CK为清水对照；1-3：爪哇根结线虫DNA为模板的检测结果。