[发明专利]一种快速检测O-GlcNAc修饰的生物感应器/方法及应用有效
申请号: | 201810485141.5 | 申请日: | 2018-05-21 |
公开(公告)号: | CN110514628A | 公开(公告)日: | 2019-11-29 |
发明(设计)人: | 顾玉超;衣雨娇;张瑜;于文功 | 申请(专利权)人: | 中国海洋大学 |
主分类号: | G01N21/64 | 分类号: | G01N21/64;G01N33/68 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 266100 山*** | 国省代码: | 山东;37 |
权利要求书: | 查看更多 | 说明书: | 查看更多 |
摘要: | |||
搜索关键词: | 生物感应器 修饰 肽段 检测 结合蛋白 目的蛋白 荧光能量 共振 结合能 生物工程技术领域 荧光共振能量转移 大肠杆菌 糖基转移酶 分子克隆 距离缩短 快速检测 阴性对照 荧光蛋白 构建 可用 位点 荧光 突变 灵敏 蛋白 应用 | ||
1.一种荧光能量共振转移(FRET)的生物感应器检测蛋白及肽段O-GlcNAc修饰及修饰位点的方法,其特征在于,采用基因克隆技术选择并获得能发生“荧光能量共振转移”的荧光蛋白对(eCFP 与Venus)的基因序列,并通过将凝集素GafD与目的蛋白(或肽段)依次连接在这对荧光蛋白中间,获得检测目标特定的生物感应器;通过在大肠杆菌与O-GlcNAc糖基转移酶构建共表达系统,诱导表达后当生物感应器内的目的蛋白或肽段发生O-GlcNAc修饰,凝集素GafD与O-GlcNAc结合使得“荧光对”距离至10nm内,导致其荧光共振能量转移效率的变化,据此推测目的蛋白或肽段是否有O-GlcNAc修饰。
2.根据权利要求1所述的生物感应器检测蛋白及肽段O-GlcNAc修饰及修饰位点的方法,其特征为;
(1)发生荧光共振转移“荧光蛋白对”是:增强型青色荧光蛋白(eCFP)和黄色荧光蛋白(Venus);
(2)GlcNAc结合蛋白:能够与GlcNAc结合的凝集素和单链抗体等,例如文献中报道的凝集素GafD;
(3)检测O-GlcNAc修饰的生物感应器的设计和构建:在荧光蛋白对之间插入凝集素GafD,在该凝集素一边通过柔性Linker连接目的蛋白或肽段,其基本结构是“-FP1(eCFP)-GafD-Linker-目的蛋白或肽段-Linker-FP2(Venus)-”;
(4)生物感应器的阳性对照的设计和构建:通过一段柔性Linker将发生荧光共振转移的“荧光蛋白对(eCFP和Venus)”连接起来,其本结构是“-FP1(eCFP)-Linker-FP2(Venus)-”;
(5)在大肠杆菌BL21(DE3)中建立生物感应器与糖基转移酶的共表达系统:以质粒为载体,将上述序列克隆到原核表达载体启动子后,转入含有糖基转移酶基因的表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中,使用诱导剂IPTG及阿拉伯糖诱导生物感应器及糖基转移酶OGT共表达;
(6)生物感应器荧光共振能量转移效率评价目的蛋白或肽段的是否有O-GlcNAc修饰:当生物感应器内的目的蛋白或肽段发生O-GlcNAc修饰,凝集素GafD与O-GlcNAc结合使得“荧光对”距离至10nm内,导致其荧光共振能量转移效率(E)升高;采用多功能酶标仪通过观察生物感应器较阴性对照的FRET 效率(E 值)变化,推测目的蛋白或肽段是否有O-GlcNAc修饰。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国海洋大学,未经中国海洋大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服】
本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201810485141.5/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。