[发明专利]一种简便快速鉴别鸟类性别的方法

说明书

本发明公开了一种快速鉴别鸟类性别的特异性核苷酸为：SEQ ID NO:1‑2所示的核苷酸。其鉴别方法：首先，从鸟类羽毛羽根中分别提取DNA，加入组织缓冲液与蛋白酶k处理后，无需纯化，吸取上清液直接作为PCR模板DNA，而后利用该特异性核苷酸引物进行PCR扩增，PCR产物加入不含SDS的Loading Buffer后，经1.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳后，DNA图谱为单一条带，可以判定该个体性别为雄性；电泳后，DNA图谱为两条带，可以判定该个体性别为雌性；本发明的方法摒弃了翻肛鉴别、腹腔镜检等损伤性方法，采用了拔取羽毛作为样本的非损伤性方法具有简便快捷，省时省力，成本更低，实用性更强的特点。

技术领域

本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法领域，特别是涉及一种无创伤式经济快捷且操作简单的鸟类性别鉴定的检验方法。

背景技术

在全世界现有鸟类中有超过50%的品种为单态性鸟类，即指无论处于幼鸟或处于成鸟时期，均无法通过外观及其它行为判断其性别。目前，常用于鉴定鸟类性别的方法主要包括翻肛鉴别、腹腔镜检、粪便类固醇鉴定、核型分析法等，但以上方法存在应激性伤害性强、准确性不高、操作复杂困难等缺点。因此，建立一种准确简便且为非损伤性取样的方法十分重要，目前利用分子生物学技术手段，通过聚合酶链式反应(PCＲ)扩增法使得鸟类性别鉴定取得突破性进展，其中较多被鉴定的序列包括Ellegren等（1996）提出的CHD1基因、Friddfssen等（1998）提出的ATP5A1基因及Itch等（2001）提出的EE0. 6序列等。CHD1基因应用最为普遍，该基因位于性染色体，Griffiths等（1998）提出雌鸟拥有两个同源拷贝CHDZ和CHDW, 而雄鸟只拥有前者，由于二者具有一定同源性，因此引物设计尤为重要。据报道，已有研究对一些珍惜禽类如火烈鸟、朱鹮、丹顶鹤等，通过分子生物学进行了性别鉴定，并取得显著进展。然而，现有的研究涉及繁育保育越来越多的鹦鹉、鸽子以及鹩哥的内容较少，鹦鹉、鸽子以及鹩哥均属于单形态鸟类，无法通过外观分辨其性别，其中鹦鹉作为鸟纲最大科之一的种类更是繁多，包括2科、82属、358种，并全部列入《世界自然保护联盟》（IUCN）2012年濒危物种红色名录ver 3.1中。此外，通过现有的引物对鹦鹉和鸽子进行了性别鉴定，发现现有的引物与鹦鹉、鸽子以及鹩哥的基因组吻合度较低，无法扩增出两者的CHD1基因，PCR效果较差，并且即便扩增出产物，却出现已知性别的雌性和雄性均只出现雄性一条带，而不出现特异性的雌性条带，甚至出现大量非特异性杂带，研究结果表明利用现有的引物及方法无法对鹦鹉、鸽子以及鹩哥进行准确的性别鉴定。因此快速准确地进行性别鉴定对鹦鹉、鸽子以及鹩哥的育种、保护及生产都具有十分重大的意义和经济价值，还可为今后人工饲养繁殖濒危鸟类以及国际交流濒危鸟类提供可靠的技术资料，对鸟类生态学、细胞遗传学、进化生物学和分类学等研究都有重要的意义。此外，现在应用的通过非损伤性取样方法主要为拔取带有羽根的羽毛，而从羽毛组织中提取DNA的方法主要为用苯酚氯仿萃取法，该方法为耗时长的DNA纯化法，样本需研磨、破碎等特殊处理，且苯酚、氯仿均为有毒化学试剂，对环境具有一定的污染，因此对从羽毛组织中提取DNA的过程进行优化是十分有意义的。

发明内容

为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种应用范围广泛，灵敏度高，稳定性强，准确有效，方便快捷的鸟类性别鉴定方法。在对从外观上无法辨别性别的鸟类进行性别鉴定的研究中，提高对目的鸟类应用的广泛性，减少对动物模型的损伤，减少人力，减少污染，减少成本，操作流程简便快捷，提高实验的准确率、成功率并使实验结果更具科学性和可靠性。

本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是:

通过对比基因组法对NCBI数据库中公布的多种鸟类的CHD1 序列进行比对，确定在所有鸟类中较为保守的区域，设计一对原创性引物，引物名称为TDM1012F（核苷酸序列如SEQID NO:1 所示，5’-CGTGGCAACAGAGTACTGATT-3’和

TDM1020R（核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示）5’-CCATACCTCTGATCCTTCTGC-3’。