[发明专利]精子细胞表面标志物的筛选与应用

权利要求书

1.一种筛选生精细胞表面标志物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因敲入雄鼠；其中，所述表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因敲入雄鼠还表达未分化型精原细胞特异性表达基因的报告基因；

(2)对所述雄鼠实施精子发生同步化处理；

(3)获取所述雄鼠同步化后的不同发育阶段的生精细胞；和

(4)对所述生精细胞进行转录组测序，建立精子发生过程中的转录图谱，对转录图谱进行分析，从而筛选获得生精细胞内差异表达的蛋白，作为生精细胞表面标志物；其中，对转录图谱进行的分析中，通过t-SNE将生精细胞进行分类，并通过比较不同的表面标志物在各类细胞内的表达情况，筛选得到差异表达的表面标志物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述生殖细胞特异性表达基因为Vasa基因或Dazl基因；和/或

所述报告基因含有所述生殖细胞特异性表达基因和荧光蛋白的编码序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未分化型精原细胞特异性表达基因为Lin28基因或Plzf基因，和/或所述未分化型精原细胞特异性表达基因的报告基因含有未分化型精原细胞特异性表达基因和荧光蛋白编码序列。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白颜色不同于所述表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因中的荧光蛋白颜色。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。

6.如权利要求1～2中任一项所述的方法，其特征在于，所述精子发生同步化处理包括：从所述雄鼠出生第二天起连续7天饲喂维甲酸合成的抑制剂，在第8天给予维甲酸。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述维甲酸合成的抑制剂为WIN18,446。

8.选自以下的应用：

(1)Cd63和Cd177或其基因序列在分选早期圆形精子RS2中的应用；

(2)Cd63和Cd177的检测试剂在分选早期圆形精子RS2中的应用；

(3)Cd37和Cd96或其基因序列在分选晚期圆形精子RS8中的应用；

(4)Cd37和Cd96的检测试剂在分选晚期圆形精子RS8中的应用；

(5)Cd63和Cd177的检测试剂在制备用于分选早期圆形精子RS2的试剂盒中的应用；和

(6)Cd37和Cd96的检测试剂在制备用于分选晚期圆形精子RS8的试剂盒中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为所述Cd37、Cd63、Cd96和Cd177的特异性抗体或其抗原结合片段。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗体携带荧光标记。

11.如权利要求8～10中任一项所述的应用，其特征在于，所述精子为哺乳动物的精子。

12.如权利要求8～10中任一项所述的应用，其特征在于，所述精子为啮齿类动物的精子。

13.如权利要求8～10中任一项所述的应用，其特征在于，所述精子为人的精子。

14.一种分选不同发育阶段的圆形精子细胞的方法，所述方法包括：

(1)制备含生精细胞的悬液，任选地对生精细胞进行Hoechst染色；

(2)使用Cd63和Cd177的检测试剂孵育所述生精细胞；和

(3)根据所述检测试剂发出的信号分选出早期圆形精子RS2。