[发明专利]一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种端粒酶活性检测方法，包括：利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶；利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应，反应产物与信号探针溶液进行杂交反应；用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测。本发明采用超分辨成像技术能够检测到低浓度端粒酶形成的微弱信号，实现了更高灵敏度的端粒酶活性检测；采用Cy5染料修饰的端粒互补序列DNA作为信号探针，获得更高分辨率的图像及更低的检测限；避免了PCR反应过程以及信号扩增过程，大大简化了端粒酶活性检测步骤，同时也提高了检测结果的可靠性。

技术领域

本发明涉及端粒酶活性检测领域，涉及检测端粒酶活性方法，更为具体的说是涉及一种具体是通过超分辨成像技术检测端粒酶活性的方法。

背景技术

端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一种特殊结构。端粒和端粒结合蛋白一起在染色体末端形成“帽状”结构，维持染色体的完整和细胞活性。端粒会随着细胞的不断分裂而缩短，这会严重影响细胞的增殖，最终导致细胞凋亡。端粒酶是一种由RNA和蛋白组成的核糖核蛋白，能在染色体末端不断合成端粒序列，从而在细胞分裂过程中维持端粒的长度。正常体细胞中的端粒酶的活性被抑制，然而85％以上的肿瘤细胞显端粒酶活性，因此端粒酶与肿瘤的发生有着密切的关系。端粒酶不仅可以作为癌症早期诊断依据和预后指标，还能够成为癌症治疗的有效靶点。因此，对于端粒酶结构、功能、活性及作用机理的研究具有实际应用价值。

端粒酶的检测方法主要可分为直接引物延伸法和端粒重复序列扩增法(telomeric repeatamplificationprotocol，TRAP)两类。其中端粒重复序列扩增法通过PCR扩增端粒酶合成的端粒序列，由于扩增过程受许多因素影响，在提高检测灵敏度的同时容易造成假阴性的结果。此外还有比色法、化学发光法、表面等离子激元共振法、荧光共振能量转移法等避免了PCR过程的检测端粒酶的方法，他们或多多少存在一些诸如检测灵敏度不够，过程复杂的缺点。因此，具有低检测限，高灵敏度，检测过程简便的端粒酶检测方法亟待提出。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种端粒酶活性检测方法，利用超分辨成像超越衍射极限的高空间分辨率能够检测低浓度的端粒酶活性，且无需复杂的信号扩增步骤。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，包括如下步骤：

第一步，利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶；

第二步，利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应，反应产物与信号探针溶液进行杂交反应；所述的捕获探针为掺杂染料的二氧化硅纳米球表面修饰端粒酶底物；所述的信号探针为修饰了染料分子的端粒互补序列；

第三步，用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测，根据获得的两个通道的图像上点的重合情况以及DNA探针的荧光信号所获得的图像上点的大小判断端粒酶的活性。信号探针的荧光越强，说明端粒酶活性越高。

进一步的，所述第二步中延伸反应步骤为：取200-300μL捕获探针，与5μL 10mMdNTPs、1-2μL RNA酶抑制剂、5μL第一步中得到的端粒酶提取物混合，于30℃下振荡1-2小时进行端粒延伸反应；所述反应产物与信号探针的杂交反应步骤包括：延伸反应产物以2500-3000转，15分钟离心提纯1次；去除上清后，将沉淀分散至200-300μL的PBS溶液中，再加入0.3-0.9μL10μM的信号探针进行杂交反应；该混合液30℃振荡2-3小时，以2500g，15min离心提纯，去除上清液，将杂交产物的沉淀分散至500-800μLPBS中。

进一步的，所述捕获探针的制备方法包括如下步骤：