[发明专利]一种对膜电荷响应的比率荧光探针及其在细菌检测的应用

说明书

本发明提供一种对膜电荷响应的比率荧光探针及其在细菌检测的应用，其结构为二联咪唑盐两端连接有两个芘荧光团，能够发射芘单体或芘激基复合物荧光，分别在375nm和482nm，其结构如(1)所示。该化合物带有2个正电荷，在水溶液中由于疏水作用形成纳米聚集体而导致荧光淬灭。细菌表面带有大量的电荷，与探针纳米聚集体作用将其解聚引起荧光大幅度增强。由于细菌表面电荷分布不同，导致探针形成不同程度的单体和二聚体，从而产生芘单体和激基复合物荧光的比率变化(I₄₈₂/I₃₇₅)。以探针聚合物与细菌结合后产生的荧光增强，以及单体与激基复合物荧光比率变化作为荧光信号，能够识别革兰氏阴性菌或阳性菌，并且能够区分不同种类的细菌。

技术领域

本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种对膜电荷响应的比率荧光探针及其在细菌检测的应用。

背景技术

细菌，无论是致病菌还是非致病菌，都普遍存在于生物界。细菌的生长于我们的生活息息相关，每一个人的身体中大概有500-1000种不同种类的细菌数量占到了人体所有活细胞的90％，这些细菌人体的自身循环行使着各自的功能。但同时，细菌污染造成的食源性疾病也是食品安全中最突出的问题。我国每年发生的细菌性食物中毒事件占食物中毒事件总数的30％-90％，人数占食物中毒总人数的60％-90％。因此，细菌的鉴别与检测在医疗诊断、生物学和食品安全等很多领域都非常重要。另外，细菌鉴定在发现病原体爆发、监测感染趋势和识别新威胁的出现方面也起着重要作用。目前常用的细菌检测法包括：聚合酶链式反应、单细胞和基因组DNA测序和靶向特异性免疫测定等生物学方法。但是这些传统的检测方法存在耗时长、操作繁琐，价格昂贵或者是重复性差、灵敏度低等缺点。因此，用于细菌检测的新方法的开发仍然面临巨大的挑战。

荧光检测法因具有快速、简单、灵敏、能够实时监测等优点而被开发应用于细菌的检测。已报到的荧光法检测细菌分为特异性检测和非特异性检测两种：特异性识别就是对细菌特有靶标分子的专一荧光检测，如细菌分泌的特异性蛋白酶、细菌鞭毛的甘露糖受体或者细菌表面的N-乙酰葡糖胺等，然而，这一探针只能单一检测某一种细菌，不具有普适性。非特异性检测利用了因不同细菌的表面结构和组成的不同而引起的带电量差异，通过探针与细菌的静电相互作用产生的荧光信号来鉴别细菌。考虑到非特异性途径的普遍性和简单性，对不同细菌的选择性鉴定具有重要意义。

近年来，基于静电相互作用识别细菌的荧光探针已被报道，如Bunz研究组有效地设计了一种基于聚合物/肽复合物的传感器阵列，用于快速鉴别人类尿液中的14种细菌；一种层层组装的超分子纳米组件被开发用于响应细菌消除和有效的细菌检测；另外，利用对不同细菌产生不同响应信号的多个聚集诱导发光探针，通过阵列法可以识别八种细菌。然而，目前报道的荧光探针均是基于阵列方法检测细菌，需要多个化合物的同时使用才能够实现对不同种属微小差异的区分，这种方法存在操作繁琐，重复性差，适用范围小的问题，并且只能够将不同种类细菌进行区分，不具有识别细菌的能力，如识别革兰氏阴性或阳性菌。因此，具有识别和区分不同种类细菌能力的单一荧光探针，并具细菌检测简单、快速和灵敏特性的新型荧光探针仍有待开发。

比率荧光探针通常含有两个发射波长，检测时通过发射波长的比率变化可以定性或者定量的检测目标分子。芘是一个传统的荧光团，发射400nm左右的单体荧光；而两个芘荧光团容易形成激基复合物而发射480nm左右的长波长荧光。通过控制芘分子间的距离，能够产生芘单体与激基复合物的荧光变化，因此芘常用于设计比率荧光探针。本发明就是利用芘的这一性质通过比率变化检测不同种类的细菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种对膜电荷响应的比率荧光探针及其在细菌检测的应用。这一探针通过荧光增强和荧光比率变化作为信号检测带不同电荷的细菌，能够识别革兰氏阴性和阳性菌，并能够区分不同种类细菌，具有制备方法简单，检测灵敏快速的特点，性能优于已有的细菌检测探针。