[发明专利]一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法及生产β-丙氨酸的方法

说明书

本发明涉及一种固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶的方法。所述方法步骤如下：配置L‑天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，活化树脂交联固化，得固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶。本发明还涉及一种生产β‑丙氨酸的方法，采用固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶为酶源制备而得。通过利用本发明获得的固定化酶进行生产获得的产物纯度高，容易分离；因此本发明在β‑丙氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化前景。

技术领域

本发明涉及一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，还涉及一种生产β-丙氨酸的方法，属于生物技术生产氨基酸的技术领域。

背景技术

β-丙氨酸是天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，广泛应用于医药、食品等领域；在医药产品方面主要用于合成泛酸、泛酸钙、肌肽、巴柳氮和帕米磷酸钠；在食品方面主要用于食品的营养添加剂。最早生产β-丙氨酸是主要依靠化学合成法，但是随着对微生物法生产β-丙氨酸研究的深入，这种方法已经走向实用并处于主导地位。微生物法可以分为发酵法、微生物转化法和酶法合成法。其中酶法合成法是利用微生物泛酸生物合成途径的关键酶L-天冬氨酸α-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱α位羧基生成β-丙氨酸。酶法生产β-丙氨酸具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少以及精制操作容易等优点，是一种高效、廉价生产β-丙氨酸的方法。

2006年，郭恒华等报道了利用重组大肠杆菌菌株生产β-丙氨酸的方法。该技术以工程菌为酶源，不利于后续的分离纯化，并且不能重复利用，成本相对较高。焦庆才(CN107012180A)等利用多酶偶联转化马来酸制备β-丙氨酸的方法；该技术采用多酶体系偶联催化，各种酶的最佳催化条件不同，导致酶活利用率低，底物转化不彻底。因此，有必要提出有效的技术方案，解决上述问题。

发明内容

本发明针对上述现有技术成本高、底物反应不彻底的不足，提供一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法及一种生产β-丙氨酸的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，所述方法步骤如下：

①配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液：将活性1000U/g～10000U/g的L-天冬氨酸α脱羧酶用质量浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液溶解，再溶解温度为4～10℃，制备出L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液；

所述L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液中L-天冬氨酸α脱羧酶活力为50U/mL；

②交联固化：将活化树脂置于反应器中，温度保持在0～10℃条件下，加入L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理30～60min；待活化树脂充分吸附酶并牢固结合后，加入戊二醛溶液，室温下搅拌1～2h，过滤收集固定化酶，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L-天冬氨酸α脱羧酶树脂；在-80℃条件下冷冻干燥24h，4℃冰箱保藏备用；

所述活化树脂的质量与L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1g:(50～100)ml；活化树脂的质量与戊二醛溶液的体积比为1g:(5～10)ml。

优选地，所述活化树脂的制备方法包括：将树脂用95％乙醇浸泡振荡洗涤4h，用4％HCl振荡洗涤1h，4％NaOH振荡洗涤1h，得初级活化树脂；将初级活化树脂与浓度为10％的碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，过滤出的树脂用去离子水洗涤，然后将过滤洗涤后的树脂按树脂：NaCO₃：去离子水＝1:0.2～0.9:30～100的质量比配成混合液，用NaOH溶液调节混合液pH至9～12，搅拌条件下降温至-5℃以下，加入固化剂保温1h，得到活化树脂。

优选地，所述戊二醛溶液中戊二醛体积分数5％～10％。

优选地，所述树脂为LKZ128树脂、AB-8和ES-2树脂中的一种。

优选地，所述固化剂为溴化氰，加入量为树脂质量的0.5％～1％。