[发明专利]一种提高L-精氨酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种通过基因工程提高L‑精氨酸产生菌生产能力的方法，包括下述步骤：敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)；对基因敲除菌株的基因组中argB基因进行A26V和M31V突变，获得基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V))；对基因突变菌株的基因组中脲酶基因UreA(NCgl0083)起始密码子上游调控区的碱基序列进行突变，获得基因工程菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V),NCgl0083mut2)。本发明的方法能够将菌株的L‑精氨酸生产能力提高15倍。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种提高L-精氨酸产量的方法，尤其涉及一种提高L-精氨酸产生菌生产能力的方法。

背景技术

L-精氨酸(L-argnine，简称L-Arg)是人体内所需半必需碱性氨基酸之一，作为一种含有胍基的碱性氨基酸，是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物，具有多种独特的生理和药理作用，对于治疗生理功能、心血管疾病、激励免疫系统、维持婴儿的营养平衡、促进人体解毒等都具有良好的疗效，被专家称为是机体内运输和贮存氨基酸的重要载体，在肌内代谢中极为重要。它是合成胞浆蛋白和核蛋白的必需氨基酸；作为唯一的氨来源参与肌酸的合成；作为尿素循环的重要中间体，在肝脏中扮演着排除多余氨的角色，防止氨过量积累而引起中毒；它还具有调节人体免疫力的功能，可抑制肿瘤生长、促进受伤组织愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。因此，L-精氨酸在医药、食品及化工领域方面具有重要而广泛的应用。比如，在临床上，除作为复方氨基酸输液的主要组分之一外，L-精氨酸及其盐类还广泛用于治疗各类肝昏迷忌用谷氨酸钠者和病毒性肝类谷丙转氨酶异常者，对病毒性肝炎疗效显著。对肠道溃疡、血栓形成和神经衰弱等症都有治疗效果。另外，L-精氨酸是运动营养饮料配方的重要组成部分，也是一种重要的饲料添加剂，还广泛地应用于高端养殖业。据统计，目前全世界L-精氨酸需求量在15000吨以上，并且需求量以每年12％-15％的速度增长。

L-精氨酸的生产方法有两种：一是蛋白质水解提取法，二是微生物发酵法。水解法存在操作费时，收率和产量低，成本高等问题，并且存在严重的污染而不适合大规模的生产。发酵法生产L-精氨酸工艺相对简单，且对环境友好，因此具有很大的发展潜力，成为国内外氨基酸工业的一个重要趋势。国际上著名的氨基酸公司比如日本味之素、协和发酵和德国迪高沙主要采用生物发酵和基因工程技术进行L-精氨酸生产。但是，国内的微生物发酵生产L-精氨酸的产酸水平普遍较低，成本较高，生产水平和产量远远不能满足国内需求，因此提高L-精氨酸发酵水平的研究具有重要的意义。

L-精氨酸的发酵菌种研究得较多的主要有谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等，但目前用来生产L-精氨酸的微生物菌株主要是谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌。基因工程技术对于精氨酸高产菌选育具有重要的推动作用，利用基因工程构建L-精氨酸高产菌株是一种高效率、理性化的育种手段，但构建筛选出适合于工业规模生产的高产重组菌始终是一种迫切的需求。

发明内容

为了克服现有L-精氨酸生产菌株发酵水平低的缺陷，本发明利用基因工程技术来改造谷氨酸棒杆菌，通过增强与L-精氨酸产生相关的基因、弱化分支代谢途径，能够大幅度提高菌株的L-精氨酸生产能力。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高L-精氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：

A.敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)；