[发明专利]一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒包含包被有新型鸡呼肠孤病毒σC 蛋白重组抗原的酶标板；

所述新型鸡呼肠孤病毒σC 蛋白重组抗原的制备方法如下：

以保藏编号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒的全基因序列为模板，利用引物对扩增得到σC 基因片段，构建重组表达载体，通过原核表达系统表达新型鸡呼肠孤病毒σC 蛋白重组抗原；

所述引物对的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，将所述重组表达载体转化至BL21感受态细胞中，加入IPTG进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的新型鸡呼肠孤病毒σC 蛋白重组抗原。

3.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述新型鸡呼肠孤病毒σC 蛋白重组抗原的包被量为500ng/孔。

4.根据权利要求1-3任一项所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒还包含：酶标抗体、样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、B和终止液。

5.根据权利要求4所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为酶标兔抗鸡抗体。

6.一种新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）包被：以保藏编号为CCTCC NO：V201817的新型鸡呼肠孤病毒σC重组蛋白作为包被抗原，将抗原稀释后加入到酶标板孔中，4℃孵育过夜或37℃孵育2-4h，采用含0.05%吐温的PBST洗涤；

（2）封闭：采用PBST稀释5%脱脂奶粉200μL/孔进行封闭，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤；

（3）血清作用条件：每孔加入待检血清稀释混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤；

（4）添加酶标抗体：将酶标兔抗鸡抗体用PBST按1：500稀释，每孔加100μl，37℃条件下作用1h后甩干，用PBST洗涤；

（5）底物显色：TMB底物显色液100μL/孔，37℃条件下避光作用15min；

（6）终止反应：每孔加50μL终止液终止显色反应；采用酶标仪吸光度450nm下读取数据；

（7）阴阳性临界值的确定：根据公式：阴阳性临界值=阴性样本OD₄₅₀平均值+标准偏差3SD，得到阴阳性临界值；当OD₄₅₀在0.071以上，判定为阳性；

步骤（1）中，所述新型鸡呼肠孤病毒σC重组蛋白由如下方法制备而成：

以保藏编号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒的全基因序列为模板，利用引物对扩增得到σC 基因片段，构建重组表达载体；将重组表达载体转化至BL21感受态细胞中，加入IPTG进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的鸡呼肠孤病毒σC重组蛋白；

所述引物对的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。