[发明专利]酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法

说明书

本发明提供了一种酿酒酵母工程菌的构建方法及利用该酿酒酵母工程菌制备桦木酸的方法，所述酿酒酵母工程菌为，在酿酒酵母中导入了羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs和细胞色素P450酶编码基因RoCYP‑34445、细胞色素P450还原酶编码基因RoCPR，该基因能够编码桦木酸生物合成途径中的关键酶，构建得到的工程菌采用生物合成的方法制备桦木酸，该方法羽扇豆醇转化为桦木酸的转化率高，产量大，且环境友好。

技术领域

本发明涉及合成生物学领域，特别涉及一种酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法。

背景技术

桦木酸(betulinic acid)和以其为起始物的衍生物在抗肿瘤和抗HIV新药创制方面表现出光明的应用前景。早在1995年，桦木酸具有很好的抗黑色素瘤的作用。之后，以桦木酸为起始物，许多强抗肿瘤活性衍生物被合成。

此外，许多桦木酸衍生物具有很好的抗HIV的作用。例如3-O-(3,3-dimethylsuccinyl)betulinic acid(bevirimat)对野生型和耐药型HIV-1都有强抑制其复制的作用，并且该化合物已经在I和II期临床取得成功。近期，通过以桦木酸为起始物，许多新的抗HIV衍生物被合成出来，其中一些化合物可抑制耐bevirimat HIV-1的变种病毒。

以上桦木酸衍生物均是已桦木酸为起始化合物，通过半合成的方法获得的。因此，对这些分子进行新药开发，首先解决的关键问题是药源问题，即如何获得工业化规模的桦木酸。桦木酸在白桦树皮中的含量最高，但是也只有0.025％。由于桦木醇在白桦树皮中含量高(25％)，因此目前主要以桦木醇为起始物，半合成桦木酸。半合成的方法制备桦木酸，同样需要大量提取植物材料，并且在化学合成中使用大量化学试剂，环境不友好。近期，有研究报道了一个能够分别氧化齐墩果烷和熊果烷为齐墩果酸和熊果酸的酶CYP716AL1。由于该酶具有一定底物选择的泛宽性，也可氧化羽扇豆醇得少量桦木酸。以CYP716AL1催化最后一步氧化反应，在酿酒酵母中重建桦木酸的生物合成途径，但其产量仅为0.01mg/L，产量很低。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于提供一种产量高、环境友好的桦木酸生物合成方法。

具体技术方案如下：

一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括：向酿酒酵母中转化含有细胞色素还原酶基因RoCPR和细胞色素P450基因RoCYP-34445的重组质粒。

所述细胞色素还原酶基因RoCPR，以迷迭香cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.IDNO.8所示的RoCPR-F和核苷酸序列如SEQ.ID NO.9所示的RoCPR-R为引物，经PCR扩增得到；所述迷迭香cDNA由提取迷迭香的总RNA后进行反转录得到。

所述细胞色素P450基因RoCYP-34445为，以迷迭香cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.ID NO.18所示的RoCYP-34445-F、和核苷酸序列如SEQ.ID NO.19所示的RoCYP-34445-R为引物，经PCR扩增得到；所述迷迭香cDNA由提取迷迭香的总RNA后进行反转录得到。

优选地，上述酿酒酵母工程菌的构建方法还包括：向酿酒酵母中转化入含有羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs的重组质粒。

所述羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs为，以拟南芥cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示的LUP-F、和核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示的LUP-R为引物，PCR扩增得到；所述拟南芥cDNA由提取拟南芥的总RNA后进行反转录得到。

优选地，所述细胞色素还原酶基因RoCPR的核苷酸序列如SEQ.ID NO.7所示。

优选地，所述细胞色素P450基因RoCYP-34445的核苷酸序列如SEQ.ID NO.17所示。