[发明专利]一种妥布霉素免疫检测试剂及其制备和检测方法

说明书

本发明公开了一种妥布霉素免疫检测试剂及其制备和检测方法。包括：酶标妥布霉素、用于检测妥布霉素抗体‑酶标妥布霉素复合物的指示试剂；上述酶标妥布霉素由妥布霉素和葡萄糖脱氢酶偶联而成。本发明的妥布霉素免疫检测试剂可以精确快速地确定人体血液等样品中妥布霉素含量。与市场上现有的检测试剂相比，本发明检测试剂具有方便快速、灵敏度高、特异性强、定量准确等优点，有利于临床的推广使用。

技术领域

本发明涉及医学检验领域，具体是一种妥布霉素免疫检测试剂及其制备和检测方法。

背景技术

妥布霉素（Tobramycin, TOB）是第二代氨基糖苷类抗生素，相对第一代氨基糖苷类抗生素而言，其疗效更好、毒性更低，通常用于注射给药，治疗严重的革兰氏阴性菌感染，成为目前世界临床应用最为广泛的氨基糖甙类抗生素之一。妥布霉素在兽药领域也获得了较广泛的使用，因此其在肉类、奶类等人们常用的食品中也有存在。由于其安全的治疗浓度为4 mg/L-8 mg/L，长时间血药浓度超过8 mg/L就可能引起严重的肾毒性与耳毒性。所以在有关食品等样品中对妥布霉素进行快速、灵敏的测定很有必要。

目前检测妥布霉素的常用方法有：高效液相色谱分析、微生物法和毛细管电泳法等。其中，高效液相色谱分析费时且不易自动化，并且使用紫外检测时需要衍生；微生物法所需时间较长，检测结果重复性较差；毛细管电泳法灵敏度较低并且重现性较差。

本发明采用的方法为均相酶免疫检测法，其优点为：操作简便、快速、灵敏度高、准确性好、适合于自动化，应用广泛，并且用全自动生化分析仪对小分子物质和大分子物质都能高通量快速测定。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中妥布霉素检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，本发明提供了一种快速、灵敏度高、准确检测出待测样本中妥布霉素含量的妥布霉素均相酶免疫检测试剂及其制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种妥布霉素免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标妥布霉素、用于检测妥布霉素抗体-酶标妥布霉素复合物的指示试剂；上述酶标妥布霉素由妥布霉素和葡萄糖脱氢酶偶联而成。

作为本发明进一步的方案，所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-妥布霉素偶联物；上述酶的底物为葡萄糖。

作为本发明进一步的方案，所述的一种妥布霉素免疫检测试剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）葡萄糖脱氢酶-妥布霉素偶联物的制备：葡萄糖脱氢酶（GDH）与妥布霉素偶联，纯化偶联的酶标抗原。

（2）妥布霉素均相酶免疫检测试剂的制备：

试剂1的制备：由妥布霉素抗体和均相酶底物混合而成；

试剂2的制备：由葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物与磷酸盐缓冲液混合而成。

作为本发明进一步的方案，所述的一种妥布霉素免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体过程为：

1）葡萄糖脱氢酶（GDH）与妥布霉素的偶联

a. 将5-30 mg妥布霉素溶于100-500 μL二甲基甲酰胺（DMF）中，轻微振荡溶解；同时，取10-40 mg规格为100-300 KU的GDH溶解于PBS缓冲液中震荡、均匀溶解。

b. 将妥布霉素溶液在搅拌下缓慢加入GDH溶液中，同时缓慢滴入10-40 μL戊二醛溶液，滴加完毕后将溶液置于4℃搅拌反应过夜。

2）纯化偶联的酶标抗原

通过G-25凝胶层析柱纯化偶联的酶标抗原，得到葡萄糖脱氢酶-妥布霉素偶联物，于2-8℃下储存。