[发明专利]一种结合高压和低压模式的流式电转染装置

说明书

本发明提供一种流式电转染装置，包括管体，第一电极对，第二电极对，其特征在于，所述第一电极对和第二电极对相邻设置于管体的侧壁，所述管体与第一电极对形成腔体，所述管体与第二电极对形成腔体，所述第一电极对施加高压短脉宽电信号，所述第二电极对施加低压长脉宽或持续电信号。该流式电转染装置可以对大体积样品在持续稳定流动过程中进行电转染，在保证细胞存活率的前提下，显著提高细胞电转染效率和蛋白表达量。

技术领域

本发明涉及电转染的方法，特别是涉及一种流式电转染装置，具体是涉及一种结合高压和低压模式的流式电转染装置。

背景技术

细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，厚度约为7～10nm，细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类组成。各成分含量分别约为50％、40％、2％～10％。其中，脂质的主要成分为磷脂和胆固醇。此外，细胞膜中还含有少量水分、无机盐与金属离子等。磷脂双分子层是构成细胞膜的基本支架，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。周围环境中的一些小分子物质可以通过被动运输通过细胞膜，但其它大分子物质则不能自主通过细胞膜。

70年代，科学家首次发现“电穿孔”术，其电场被用于在细胞膜上形成孔，而不会引起细胞永久损伤。研究发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，所谓细胞电穿孔(Electroporation)就是指细胞在外加脉冲电场的作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔的生物物理过程。电转染(Electrotransfection)是利用电穿孔技术将外源的生物大分子，如DNA、RNA或蛋白质导入细胞的技术。电转染术已应用于试管内和体内程序，如ECM600、Bio-Rad等产品。已知的试管内及体内应用的电转染，可将瞬时高压脉冲施加于位于实施区域周围的电极上。电极之间产生的电场会使细胞膜瞬时变成多孔的，外源分子通过自由扩散或者电流的作用进入该细胞。

在已知的电转染应用中，这类电场包括1000V/cm的单个方波，脉宽大约100-100000μs。在电转染过程中，不受控制的电场和电击过程中产生的气泡，会通过改变电流在细胞壁形成永久的孔，会对细胞产生一定的损伤。而抗体生产中，工程细胞在电转染完7-21天进行蛋白质表达，对细胞活力的要求也相对较高。因此，在电转过程中提供合适的开孔电压和扩散电流，在获得高转染效率的同时，保证细胞存活率至关重要。

当细胞膜发生电穿孔时，其细胞膜表面发生跨膜电位变化，导致磷脂双分子层重排，从而导致细胞膜的通透性瞬时增大，使亲水分子、DNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜可以自我恢复，重新成为选择性通透屏障。

与传统的化学转染和病毒转染相比，由于电转染具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学、临床医学等领域有着广阔的应用前景。

虽然电转染作用的机理并不完全清楚，但在本文中细胞电转染是公知的，包括细胞膜脂双层的破裂，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过扩散进入细胞。

现有技术中，主要有三类方法来完成细胞电转染的过程：

将细胞放置于一对相距数毫米至数厘米的平行电极之间。使细胞在电极之间的电场中受到电刺激，以实现电转染的目的。例如，专利US5389069。

使用微型针状电极扎入组织或细胞液中对细胞进行电击，达到电转染的目的。例如，专利号CN101020892A。