[发明专利]一种产生N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一株生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于：所述生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌以E.coli W3110为宿主细胞，在其基因组中整合诱导型启动子控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因， T7启动子控制的来自酿酒酵母菌的Sc-gna1基因，多拷贝T7启动子控制的来自大肠杆菌的glmS基因；敲除nagA、nagB、nagC、nagE、manX、manY、manZ七个基因，整合诱导型启动子控制的dCas9基因，利用CRISPR/dCas9基因干扰技术干扰pfkA基因表达强度，使pfkA基因被关闭或以低水平表达；其中，

所述Sc-gna1基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示；

所述glmS基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示；

所述T7RNA聚合酶基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.5所示序列；

所述nagA基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.6所示；

所述nagB基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.7所示；

所述nagC基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.8所示；

所述nagE基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.9所示；

所述manX基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.10所示；

所述manY基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.11所示；

所述manZ基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.12所示；

所述pfkA基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.13所示；

所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.14所示；

所述诱导型启动子为阿拉伯糖启动子Para或鼠李糖启动子Prha，其中，

所述阿拉伯糖启动子Para的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.3所示；

所述鼠李糖启动子Prha的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述基因工程菌生产N-乙酰氨基葡萄糖方面的应用。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌的应用，其特征在于：所述基因工程菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的具体方法如下：

5L发酵罐发酵：

(1)活化斜面培养：从-80℃冰箱保菌管中接种1-2环菌种，均匀涂布于活化斜面，34-39℃培养10-15h，转接第二代活化斜面，培养10-15h；

(2)种子培养：取适量无菌水于活化斜面，将菌悬液转接至种子培养基中，pH 6.8-7.2；温度34-39℃；溶氧25-40％之间，培养至细胞干重达到2-15g/L之间；

(3)发酵培养：按照10-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2；温度维持在35-39℃；溶氧在25-40％之间；在发酵前期添加终浓度2-15g/L的诱导剂，诱导目的基因的表达，当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0-5g/L，发酵周期 为60-80h；

5L发酵罐60-80h后N-乙酰氨基葡萄糖的产量达到140-170g/L；

活化斜面培养基组成为：酵母粉3-8g/L，蛋白胨8-12g/L，牛肉膏8-12g/L，NaCl 3-8g/L，蔗糖0.5-2g/L，琼脂条15-30g/L，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min；

种子培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母粉2-10g/L，(NH₄) ₂SO₄ 1-5g/L，KH₂PO₄ 1-5g/ L，MgSO₄· 7H₂O 1-5g/L，柠檬酸1-5g/L，FeSO₄· 7H₂O 1-5mg/L，MnSO₄· 7H₂O 1-5mg/L，VH 0.05-2mg/L，VB1 0.1-2mg/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌 15min；

发酵培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母粉1-6g/L，(NH4) ₂SO₄ 1-5g/L，KH₂PO₄ 3-8g/L，MgSO₄· 7H₂O 1-5g/L，柠檬酸1-5g/L，FeSO₄· 7H₂O 30-90mg/L，MnSO₄· 7H₂O 1-5mg/L，Met 0.5-2g/L，VH 0.05-2mg/L，VB1 0.1-1mg/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2，115℃高压 蒸汽灭菌15min。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌的应用，其特征在于：所述诱导剂为阿拉伯糖或鼠李糖。