[发明专利]能同时检测促甲状腺激素受体分型抗体的酶联免疫试剂盒及检测方法

权利要求书

1.能同时检测促甲状腺激素受体分型抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括：包被抗原、预包被酶标板、漂洗液、促甲状腺激素受体抗体标准品、酶标液、样品稀释液、漂洗液、封闭液、显色液和终止液；

其中，包被抗原为促甲状腺激素受体重组抗原，通过以下方法制备得到：

(1)将TSHR片段通过PCR扩增后连接到PMD19-T上，再转入大肠杆菌中，于37℃培养过夜；

(2)提取克隆质粒，酶切，然后连接到pet-32a表达质粒上，最后转入感受态细胞中，通过IPTG诱导，于37℃进行蛋白表达；

(3)加入裂解液，在4℃进行超声，裂解包涵体后离心，取上清，纯化；

(4)将纯化物梯度透析复性，浓缩，获取纯度高于90％的重组蛋白，制得；

酶标液为辣根过氧化物酶标记的促甲状腺激素受体重组抗原。

2.根据权利要求1所述的能同时检测促甲状腺激素受体分型抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于，预包被酶标板通过以下方法制备得到：

(1)用样品稀释液将促甲状腺激素受体重组抗原稀释至50-150ng/0.1mL，然后加入酶标孔内，于37℃，孵育2h；

(2)甩掉酶标板中的液体，用漂洗液洗涤酶标板，拍干，然后加入封闭液，置于4℃封闭过夜；

(3)将封闭液甩干，用漂洗液洗涤酶标板，拍干备用。

3.根据权利要求1或2所述的能同时检测促甲状腺激素受体分型抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于，漂洗液的pH值为7.4，1L漂洗液含有以下组分：5-50mM磷酸二氢钠、5-50mM磷酸氢二钠、0.05wt％-0.5wt％NaCl、体积分数为0.01％-0.2％的吐温-20，余量为去离子水。

4.根据权利要求1或2所述的能同时检测促甲状腺激素受体分型抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于，样品稀释液为5-50mM，pH＝9.6的碳酸盐缓冲液；封闭液为含5wt％-25wt％牛血清的20mM，pH＝9.0磷酸盐缓冲液；终止液为1-3M浓硫酸。

5.根据权利要求1所述的能同时检测促甲状腺激素受体分型抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于，显色液为显色液A和显色液B按体积比为1:1混合的混合液；其中，1L显色液A包括0.1-0.25M三水合醋酸钠、0.5-5w/v％柠檬酸、0.1-1ml 30％双氧水，余量为去离子水；1L显色液B包括1-10mM乙二胺四乙酸二钠、0.5-5w/v％柠檬酸、0.01-0.1w/v％TMB，余量为去离子水。

6.根据权利要求1所述的能同时检测促甲状腺激素受体分型抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于，促甲状腺激素受体抗体标准品通过以下方法制备得到：将人血清中促甲状腺激素受体经纯化，使其纯度≥99％，然后用样品稀释液将其稀释成浓度为5IU/L、10IU/L、20IU/L、40IU/L、80IU/L、160IU/L，制得。

7.采用权利要求1-6任一项所述的酶联免疫试剂盒同时检测促甲状腺激素受体分型抗体的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

(1)包被：对预包被酶标板设置标准品孔、空白孔和样品孔，用样品稀释液将待测样品稀释10倍，然后加入样品孔内，不同浓度的标准品加入标准品孔内，空白孔加等体积的样品稀释液，然后于37℃孵育30min；

(2)洗涤：甩掉酶标板中的液体，用漂洗液洗涤，拍干；

(3)加样：加入辣根过氧化物酶标记的促甲状腺激素受体重组抗原，于37℃孵育30min；

(4)洗涤：甩掉酶标板中的液体，用漂洗液洗涤，拍干；

(5)显色：加入显色液，于37℃孵育15min；

(6)终止：加入终止液终止反应，然后在450nm下测定OD_450nm值，以标准品浓度为横坐标，以OD_450nm值为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出促甲状腺激素受体分型抗体的浓度。