[发明专利]针对DJ-1基因编辑的sgRNA筛选及其载体与应用

说明书

本发明公开了一种针对DJ‑1基因的sgRNA，通过白变蓝克隆形成实验这种原核评估体系证实了上述序列的编辑效率，证明本发明的序列具有优异的编辑效率，为以后的DJ‑1基因疗法提供参考；通过细胞增殖实验，发现DJ‑1基因敲除后的细胞株细胞增殖减缓；同时，为进一步的DJ‑1机制研究提供有效细胞工具。

技术领域

本发明属于基因技术，具体涉及针对DJ-1基因的sgRNA，具有高的编辑效率，以及包含sgRNA及其载体与应用。

背景技术

DJ-1（PARK7）是较常见的常染色体隐性遗传帕金森致病基因，其对帕金森病的致病机制不明确，有待于研究。CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats/Cas9)基因编辑系统是自ZFNs、TALENs发展而来的第三代基因编辑系统，是从细菌的适应性免疫防御系统中发现，用来对抗外源DNA以及入侵的病毒，目前已经被广泛的应用于生物医学领域。CRISPR/Cas9的特点是其设计简单、成本低廉、识别不受基因甲基化影响、编辑效率高、能同时靶向多个靶点以及含有PAM位点的任意序列等。以前的研究已经证明由crRNA的3'末端与tracrRNA的5'末端形成的sgRNA可以指导Cas9核酸酶剪切与crRNA序列互补的靶序列。剪切靶序列后，细胞修复DNA双链断裂的方式分为同源重组修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）两种。

在Shinmyo等人的研究中，3条sgRNA序列被设计用于小鼠大脑Satb2基因的敲除，但是它们之间的编辑效率差别巨大。所以，相对高效率且较低脱靶效应的sgRNA的选择对于CRISPR/Cas9基因编辑的广泛应用是决定性的。评价一个特定靶序列的sgRNA的特异性和有效性，目前有以下几种方法被广泛应用，如T7 endonuclease I 实验，PCR产物测序，Digenome-seq技术，GUIDE-seq技术，HTGTS技术，IDLV法和在线工具预测，但这些方法通常费时费力，需要的仪器设备要求较高或者预测不准确。针对特定的靶基因，大量的sgRNA序列可以被设计，因为Cas9酶可以酶切任何毗邻PAM位点的靶序列，但每一条sgRNA的编辑效率都不一样，如PAM位点是5'-NGG-3'的编辑效率通常就比5'-NGA-3'或5'-NAG-3'的高。CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的高低受到多种因素影响，其中不同sgRNA序列之间特异性的高低对其影响尤为重要。

在CRISPR/Cas9技术出现之前，在细胞层面研究基因功能，普遍使用RNA干扰（RNAi）技术，只能使基因的表达降低，而不能在DNA水平完全敲除，这是CRISPR/Cas9的最大优势。在CRISPR/Cas9应用过程中，sgRNA特异性的高低很大程度决定了CRISPR/Cas9编辑效率的高低。

发明内容

本发明公开了一种DJ-1基因最优sgRNA，为以后的基因疗法提供参考。

本发明采用如下技术方案：

一种针对DJ-1基因的sgRNA，所述针对DJ-1基因的sgRNA的序列为SEQ ID NO.1。

一种针对DJ-1基因的药物，包括SEQ ID NO.1所示的sgRNA。

上述技术方案中，所述针对DJ-1基因的药物还包括药物载体，比如常规聚合物载体、细胞载体等。

一种针对DJ-1基因的质粒，包括SEQ ID NO.1所示的sgRNA。

优选的，所述针对DJ-1基因的质粒为装载有SEQ ID NO.1所示的sgRNA的pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒。

SEQ ID NO.1所示的sgRNA在制备针对DJ-1基因药物中的应用。

SEQ ID NO.1所示的sgRNA在制备治疗或者缓解帕金森药物中的应用。