[发明专利]一种基于RPA技术的石渠棘球绦虫检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于RPA技术的石渠棘球绦虫检测试剂盒及其应用。本发明根据石渠棘球绦虫线粒体基因序列设计并筛选了一套可用于RPA检测的引物及探针组合，建立了石渠棘球绦虫特异性实时荧光RPA检测方法。该方法采用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异性结合，在DNA聚合酶的作用下延伸引物生成新的DNA链。本发明的石渠棘球绦虫特异性荧光RPA检测方法操作简便、快速、特异性强，适用于现场快速检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于RPA技术的石渠棘球绦虫检测试剂盒及其应用。

背景技术

石渠棘球绦虫(Echinococcus shiquicus)是2005年在中国四川省甘孜藏族自治州的石渠县(北纬32°19’～34°20’，东经97°20’～99°15’)被首次发现和命名的，并且被鉴定为一独立种，属于棘球属(Echinococcus)绦虫成员之一。棘球属绦虫在生物分类学上属于动物界(Animalia)、扁形动物门(Platyhelminthes)、绦虫纲(Cestoda)、圆叶目(Cyclophyllidea)、带科(Taeniidae)。棘球属绦虫的分类一直备受争议，随着分子生物学技术的不断发展和深入，不同的分类方法和标准被提出，现正在趋于统一，棘球属绦虫现公认有9个种，分别是细粒棘球绦虫狭义种(E.granulosus s.s.)、多房棘球绦虫(E.multilocularis)、伏氏棘球绦虫(E.vogeli)、少节棘球绦虫(E.oligarthra)、石渠棘球绦虫、狮棘球绦虫(E.felidis)、马棘球绦虫(E.equinus)、奥氏棘球绦虫(E.ortleppi)和加拿大棘球绦虫(E.canadensis)，在中国呈流行性分布的种主要是细粒棘球绦虫狭义种、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫。棘球属绦虫的幼虫，尤其是细粒棘球蚴和多房棘球蚴分别能够引起中间宿主(包括人)的囊型棘球蚴病(cystic echinococcosis，CE)和泡型棘球蚴病(alverolar echinococcosis，AE)，不但严重阻碍全球畜牧业的发展，而且严重威胁到人类的身体健康，是一种严重的人兽共患寄生虫病，也是部分国家(包括我国)的重大公共卫生问题之一。据估计，对人类健康造成的危害：泡型棘球蚴病和囊型棘球蚴病每年分别可造成每人5.8和0.81的伤残调整生命年(DALYs)的损失，人类对棘球蚴病的经济负担每年可达1亿DALYs(约7.64亿美元)；对畜牧业造成的危害：每年全世界畜牧生产因棘球蚴病带来的损失可能高达30亿美元。石渠棘球绦虫是我国流行的一种棘球绦虫，并且与多房棘球绦虫有诸多方面的相似性，所以对石渠棘球绦虫(蚴)种鉴定的研究对控制石渠棘球蚴病有着重要的指导意义。

多年来，国内外对于石渠棘球绦虫的诊断方法主要包括剖检法和分子生物学检测方法，其中分子生物学检测方法主要包括普通PCR、多重PCR、巢式PCR、PCR-RFLP、以及环介导等温扩增(LAMP)等。尽管上述实验方法特异性和灵敏度都很高，但是它们操作复杂，需要PCR等专业仪器设备，耗时长且需要训练有素的专业人员，有些方法还特别容易出现假阳性(LAMP)，因此这些方法的使用有诸多限制。

RPA技术是由以英国剑桥Babraham研究院建立的并由Twist Dx生物技术公司发明的(http://www.twistdx.co.uk/)。该技术以T4噬菌体的核酸复制机制为原理，反应所需原料有T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32、DNA聚合酶以及寡聚核苷酸；同时还需要引物、探针、模板、ddH₂O和Mg²⁺等。该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内DNA复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，摆脱了对热循环仪器的要求，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。

目前RPA技术已经在多种病原生物的分子检测中得到应用，如结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、犬细小病毒、非洲猪瘟、牛环型泰勒虫、隐孢子虫、弓形虫、血吸虫等。但是未见RPA技术在棘球绦虫检测中的应用。因此，建立一种简便、快速、有效的棘球绦虫RPA检测方法，对于棘球蚴病的防控具有重要意义。

发明内容