[发明专利]用于非小细胞肺癌检测及分期判断的外泌体检测装置及应用

权利要求书

1.一种用于非小细胞肺癌检测及分期判断的外泌体检测装置，其特征在于，所述装置包括：

(1)外泌体提取机构：通过离心提取细胞培养上清中的外泌体；

(2)外泌体表征机构：对所述外泌体提取机构提取得到的外泌体进行表征，以确定确实提取到了外泌体，其中，所述表征指标选自以下一种或多种：形貌、大小、浓度；

(3)外泌体蛋白表达量信息测定机构：对所述外泌体提取机构提取的外泌体进行蛋白表达量信息的测定；

优选地，所述目标蛋白选自以下一种或多种：EGFR蛋白,EGFR突变蛋白，CXCR4蛋白；

更优选地，所述EGFR突变蛋白至少包括19号外显子上E746-A750氨基酸缺失突变及21号外显子的L858R点突变；

(4)外泌体表达量信息分析机构：对所述外泌体蛋白表达量信息测定机构测定的表达量信息进行分析，进行非小细胞肺癌检测及分期判断。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述细胞选自以下一种或多种：结直肠癌细胞SW620，肺癌细胞A549，H1975，H1650。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述外泌体提取机构中，所述外泌体的提取方法选自以下一种或多种：超速离心法、微孔膜过滤法、微流通道法，优选为超速离心法，更优选地，所述超速离心法包括以下步骤：

(a)取细胞培养上清进行离心，第一次离心弃沉淀，取上清第二次离心弃掉沉淀，再次取上清第三次离心弃掉沉淀；

优选地，所述第一次离心速度为300g～1000g，优选为800g；第一次离心时间为5分钟；所述第二次离心速度为2000g～5000g，优选为2000g；第二次离心时间为10分钟；所述第三次离心速度为8000g～10000g，优选为10000g；第三次离心时间为1小时；所述离心温度为4℃；

(b)用滤膜过滤步骤(a)所得上清，过滤后的液体再次离心得沉淀，即得到外泌体；

优选地，所述滤膜孔径为0.1～0.5μm，优选为0.22μm；所述离心速度为100000～150000g，优选为100000g；所述离心时间为0.5～5小时，优选为2小时；所述离心温度为4℃。

4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述外泌体的提取还包括以下步骤：

(c)将步骤(b)离心所得的沉淀，重悬在PBS中。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其特征在于，所述外泌体提取机构中，所述细胞培养上清的培养基含10％胎牛血清；

优选地，所述外泌体提取机构还包括以下操作机构：

在外泌体提取前将细胞培养上清的培养基换成由扣除外泌体的胎牛血清配制的培养基进行培养；优选地，所述更换时间为提取前24～76小时。

6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述扣除外泌体的胎牛血清配制的培养基通过以下方法制备：

(i)将血清加入基础培养基中，使细胞培养基中FBS浓度为20％；

(ii)将步骤(i)所得细胞培养基4℃条件下，超速离心过夜；优选地，所述离心速度为100000-130000g；

(iii)超速离心结束后，收集上清，用基础培养基将含20％FBS的培养基稀释为FBS浓度为10％,加入1％的双抗；

(iv)用滤膜对培养基进行过滤，装瓶待用；优选地，所述滤膜孔径为0.22μm。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的装置，其特征在于，所述外泌体表征机构中，所述形貌表征的机构为透射电镜，优选为生物型透射电镜；所述大小表征的机构为动态光散射机构和/或纳米颗粒跟踪分析机构；所述浓度表征的机构为纳米颗粒跟踪分析机构。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的装置，其特征在于，所述蛋白表达量的测定机构为流式细胞机构和/或Western blot机构。