[发明专利]一种动物饲料添加剂及其制备方法与应用

说明书

本发明的动物饲料添加剂，为表达抗菌肽BMAP‑18的枯草芽孢杆菌裂解物，本发明采用CRISPR/Cas9技术，将表达BMAP‑18的基因多拷贝整合到枯草芽孢杆菌的基因组中，构建成高产量稳定表达的工程菌，之后对该工程菌进行大规模培养发酵，将制备的表达BMAP‑18的菌体直接裂解、高温烘干后加入动物饲料中。本发明的动物饲料添加剂，生产成本低、产量高、工程菌稳定性好，添加于动物饲料中能有效增加动物抵抗力。

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种动物饲料添加剂及其方法与应用。

背景技术

长期以来，抗生素作为饲料添加剂应用于养殖业取得了很好的效果。然而，大量的基础研究表明，抗生素在养殖业中长期大量的使用造成严重的耐药现象和畜产品药物残留，极大的威胁人类的健康安全。因此，欧盟等发达国家已经全面禁止畜禽饲料中使用抗生素，寻找抗生素替代品便成为当前研究的重要方向之一。在养殖业涉及的各类动物中，由于仔猪免疫系统发育并不完善，很容易感染有害细菌而影响其生产性能，严重者甚至死亡，因此仔猪的饲料中营养要求较高。

抗菌肽作为自然界生物中广泛存在的一种小分子活性多肽，普遍具有广谱抗菌活性，因其采用物理抗菌的机制，所以不易产生耐药性，是替代抗生素的潜在物质。但是抗菌肽的合成和纯化面临高昂的成本，而采用传统的大肠杆菌表达体系表达，虽然成本很低，但是面临内毒素难以去除的难题，限制了抗菌肽在饲料添加剂的应用。

中国专利文献CN105255935A中公开的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，解决了大肠杆菌表达体系表达的缺陷，其通过分子生物学技术，选择表达载体pHT43构建重组表达载体，构建了重组表达载体 pHT43/CC34，将重组表达载体转化到枯草芽孢杆菌WB800N中，得到表达工程菌pHT43/CC34/WB800N。该工程菌的表达产物对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有抗菌活性，可应用于医药、食品、饲料添加剂以及养殖领域。

其采用的枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，是一类好氧型、内生抗逆性孢子的革兰氏阳性菌。其细胞呈直杆状，大小为(0.8-1.2)um×(1.5-4.0) um，广泛分布于土壤及腐败的有机物中。因其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性及良好的发酵基础和生产技术，故枯草芽孢杆菌是目前生产各种工业用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表达宿主，是微生物研究领域中的一种重要模式菌株。但是，采用枯草芽孢杆菌表达蛋白，普遍存在质粒的不稳定性、转化效率低、工程菌株稳定性差、没有较多的启动子供选择等缺陷。

然而，上述中国专利文献的抗菌肽，与目前很多其他抗菌肽类似，仍存在分子量大、具有免疫原性、抗菌活性不高、热稳定性不好、对动物细胞具有毒副作用或会导致溶血等缺陷，这些缺陷在一定程度上限制了抗菌肽在饲料添加剂中的推广应用。

鉴于此，目前亟待提出一种抗菌肽，作为动物饲料添加剂可实现低生产成本、高产量、高稳定性，并能有效增加动物抵抗力。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种可实现低生产成本、高产量、高稳定性，并能有效增加动物抵抗力的动物饲料添加剂。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种抗菌肽作为动物饲料添加剂的应用。

本发明的动物饲料添加剂，所述动物饲料添加剂为表达抗菌肽 BMAP-18的枯草芽孢杆菌裂解物，所述抗菌肽BMAP-18的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列如下：GRFKRFRKKFKKLFKKLS。

优选地，所述枯草芽孢杆菌为非致病性的枯草芽孢杆菌。

本发明的制备所述的动物饲料添加剂的方法，包括如下步骤：