[发明专利]一种受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法

说明书

本发明提供了一种受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法，其中，第一纳秒脉冲激发光光源所述系统包括第一纳秒脉冲激发光光源、均匀空间光束调制部件、第二纳秒脉冲消激发光光源、网格状空间光束调制部件、二向色镜组件、显微镜镜体、微纳米平移台、镜头组件、图像采集相机、同步器以及计算机。本申请提供的受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法，能够在提高稳定性和成像速度的同时，减少系统的成本。

技术领域

本发明涉及受激辐射损耗显微镜领域，特别涉及一种受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法。

背景技术

受激发射损耗(STED,stimulated emission depletion)显微镜是一种新型的基于荧光的光学显微技术，可以在远场的情况下突破衍射极限的限制，进行高分辨率的测量。该技术旨在利用一束激光作为激发光(excitation beam)令荧光分子产生荧光。随后，通过使用另外一束激光作为消激发光(depletion beam)，将激发光产生的荧光光斑的周围荧光抑制，只让荧光光斑的中心区域发光，从而实现突破衍射极限尺寸的荧光光斑，进而实现超分辨成像。

目前，为实现基于相机的快速超分辨成像，人们希望借鉴相机成像原理，通过光束调制，将激发光调制成均匀的面光源，将消激发光调制成均匀的网格状光斑，再将两束激光进行空间同轴和时间同步，从而实现点阵状的超越衍射极限的光斑分布，也叫点阵式STED光斑。随后，通过使用高灵敏度相机，对点阵式STED光斑所成的荧光图像进行拍摄和采样，从而得到二维STED超分辨图像。

现有STED技术中，实现快速成像的方法主要是两种：一种是基于快速扫描振镜系统的成像技术，另一种就是基于点阵成像结合相机实现。

基于快速扫描振镜系统的成像技术最早被应用于共聚焦成像，随后被应用于STED成像。该技术具有结构简单，成像速度较快的特点。但由于其单点成像的特点，一幅图的起始图像点和最终图像点之间存在明显的时间差，因此难以被应用于需要有较高时间分辨率或者时间变化较快的图像样本的采样中。

而基于点阵成像的STED成像技术，目前主要是基于皮秒激光器结合 EMCCD相机来实现的。在该系统中，皮秒脉冲激光器的激发光和消激发光通过精确同步，且消激发光的脉冲宽度大于激发光的脉冲宽度，确保多余的荧光被消除。然后，通过EMCCD相机的曝光，来采集STED的点阵列图像。在该技术中，由于EMCCD的曝光时间较长，消激发光的照射时间也较长，由于消激发光一般功率很大，因此该系统对生物样本的光毒性较大，不适用于活体生物成像或长时间生物成像。且皮秒脉冲宽度对激发光和消激发光的时间同步要求很高，对控制精度和系统稳定性都提出了很高的要求，导致系统实际稳定性降低，成本增高。

发明内容

本申请的目的在于提供一种受激辐射损耗显微镜系统及其控制方法，能够在提高稳定性的同时，减少系统的成本。

为实现上述目的，本申请提供一种受激辐射损耗显微镜系统，所述系统包括第一纳秒脉冲激发光光源、均匀空间光束调制部件、第二纳秒脉冲消激发光光源、网格状空间光束调制部件、二向色镜组件、显微镜镜体、微纳米平移台、镜头组件、图像采集相机、同步器以及计算机，其中：

所述第一纳秒脉冲激发光光源发出的激发光，经所述均匀空间光束调制部件产生均匀宽场的激发光光束；所述第二纳秒脉冲消激发光光源发出的消激发光，经所述网格状空间光束调制部件生成网格状均匀的消激发光光束；所述激发光和所述消激发光通过所述二向色镜组件进行合束，形成平行且同轴的两束激光；所述两束激光被导入基于倒置荧光显微镜开发的所述显微镜镜体内，并对样本进行照射并产生点阵状分布的荧光光斑，其中，通过所述微纳米平移台来对照射点进行控制；所述显微镜镜体导出的荧光信号经过所述镜头组件由所述图像采集相机收集，其中，所述图像采集相机的曝光过程和时间由所述同步器控制，并与所述激发光和所述消激发光进行同步；所述图像采集相机产生的图像被输出到所述计算机进行处理。