[发明专利]用于提高细胞转染效率的试剂组合物

说明书

本发明涉及用于提高细胞转染效率的试剂组合物，属于生物技术领域，所述试剂组合物包含化合物BX795 0.01—10μM、化合物Ruxolitinib 0.1—100μM、化合物Tofacitinib 0.1—100μM、化合物Actinomycin D 0.1—100 nM中的2种或2种以上物质组成。这些试剂混合液与含有DNA和转染试剂的复合物或包装有目的载体的慢病毒分别加入细胞培养液中，以提高细胞的转染效率。该试剂混合物操作简便、可重复性强，使用范围大，已成功运用于L929、BJ等细胞系和小鼠原代肺纤维细胞、T淋巴细胞等原代细胞中。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于提高细胞转染效率的试剂组合物。

背景技术

基因治疗是当代医学和生物学的一个新的研究领域，其通过一定方式将正常基因或有治疗作用的DNA序列导入靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用, 从而达到治疗疾病的目的。为了达到理想的治疗效果，科学家一直在研究传送质粒DNA的有效途径。目前常规的外源表达系统主要分为两类：一类是采用病毒载体的方式，主流的三种病毒载体包括慢病毒（lentiviral）载体、逆转录（retroviral）病毒载体以及腺病毒（AAV）载体，这些方法是基因治疗等临床试验的主流选择。病毒载体如AAV载体具有高转染率、持续稳定表达外源基因的特点，但其需整合到宿主细胞的染色体中才能够使外源基因得以持续表达, 因此具有致癌、致畸的危险。安全性较差这一缺陷已成为限制病毒载体广泛应用的主要原因。另一类是采用非病毒载体的方式。这类非病毒载体安全性高，易于制备，在基因治疗中，从效果和发展前景上看，较病毒载体更具有优越性。但该类载体的导入效率和靶向性较低，较大部分宿主细胞对外源DNA抵抗性强，且外源基因转入到宿主细胞后表达时间短，短暂表达后外源基因快速关闭，这些都严重制约了该类载体的应用与发展。非病毒载体包括脂质体、高分子载体、纳米基因转运体等。

对于现有的普通细胞株或原代细胞，一般的转染方法多采用脂质体法和电穿孔的方法。阳离子脂质体表面带正电荷，与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹成DNA-脂质体复合物，能吸附在表面带负电荷的细胞膜，通过膜的融合或细胞内吞作用进入细胞体内。有时也通过细胞膜上小孔的直接渗透作用将DNA传递进入细胞。电穿孔法或电转法，是通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而将外源分子，如DNA、mRNA、蛋白、糖类等送入宿主细胞的胞浆内。但是对于很多细胞株或原代细胞，外源DNA通过非病毒载体方法进入细胞后并未能完全转录翻译成目的蛋白，表达效率较低，常常达不到实验要求。而通过电击法和病毒法进行转染的效率也不高，且实验操作过程麻烦。如何提高外源DNA在细胞内的表达成为了一个技术难题。在临床治疗方面，治疗造血系统遗传功能障碍的疾病，如联合免疫缺陷（SCID），或治疗癌症的新型手段，如嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）都有赖于一个高效转染T细胞的手段。现今用于原代T细胞进行基因改造的方法主要通过病毒感染和电穿孔的方式进行。病毒法对原代细胞进行感染时，往往需要较高的病毒滴度且通常效果不甚理想。对于T细胞而言，还需要额外的细胞因子，如IL-2和IL-7进行刺激，才能具备一定的病毒感染效率。而电穿孔的方法在操作简易度和实验周期上相比病毒法感染原代细胞更具优势。然而，该法的普及受制于电转效率、细胞存活率、实验仪器差异等诸多因素。加之原代细胞对于多种转染方法都具有较强的抵抗性，使得关于细胞进行高效基因编辑的手段较为匮乏。

本文介绍了一组试剂组合物通过对细胞免疫通路的抑制，以提高载体所运载的基因在目标细胞中的表达效率，从而用于基因治疗的临床应用。

发明内容

本发明的目的在于提供用于提高细胞转染效率的试剂组合物，试剂组合物与含有DNA和转染试剂的复合物或包装有目的载体的慢病毒分别加入细胞培养液中，以提高细胞的转染效率。该试剂混合物操作简便、可重复性强，使用范围大，已成功运用于L929、BJ等细胞系和小鼠原代小鼠成纤维细胞、原代肺纤维细胞、T淋巴细胞等原代细胞中。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：