[发明专利]斑马鱼notch2基因突变体的制备方法

权利要求书

1.一种斑马鱼notch2基因突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、确定notch2基因敲除的靶点在斑马鱼notch2基因序列的第四个外显子上；

S2、根据步骤S1确定的靶点序列设计扩增引物；所述靶点序列为如SEQ ID NO.2所示的序列；

S3、以pUC19-gRNA scaffold质粒为模板，使用引物T7-notch2-sfd、tracr rev进行PCR扩增；所述引物T7-notch2-sfd的序列为如SEQ ID NO.3所示的序列；所述引物tracr rev的序列为如SEQ ID NO.4所示的序列；

S4、对步骤S3的PCR产物进行纯化，体外转录获得gRNA；所述gRNA的序列为如SEQ IDNO.7所示的序列；

S5、将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中；具体为：将gRNA与Cas9蛋白混合，显微注射到斑马鱼一细胞期胚胎中；其中，gRNA终浓度为100ng/μL，Cas9蛋白终浓度为800ng/μL；

S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼notch2基因突变体；具体包括如下步骤：

A1、对导入gRNA与Cas9蛋白的斑马鱼48hpf后进行notch2基因敲除检测，确定notch2 F₀靶点突变效率；

A2、将notch2 F₀基因检测敲除成功的成鱼与野生型斑马鱼外交，得到F₁胚胎；经基因型鉴定获得notch2 F₁突变体斑马鱼；

A3、将相同突变的notch2 F₁突变体斑马鱼成鱼内交，获得notch2 F₂突变体斑马鱼；

A4、鉴定为F₂中notch2基因敲除的纯合子即所述稳定遗传的斑马鱼notch2基因突变体；

notch2^-/-突变体出现早期纯合致死现象。

2.根据权利要求1所述的斑马鱼notch2基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，pUC19-gRNA scaffold质粒模板序列为如SEQ ID NO.1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的斑马鱼notch2基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤A1中，notch2基因敲除检测采用的引物序列为如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。