[发明专利]基于gp5.5蛋白质的大肠杆菌总tRNA纯化方法

说明书

本发明公开一种基于gp5.5蛋白质的大肠杆菌总tRNA纯化方法，所述gp5.5蛋白质来自T7噬菌体基因5.5编码的小蛋白质或来自与所述T7噬菌体gp5.5蛋白质序列同源性高于30％并含有如序列表SEQ ID NO.1所示特征氨基酸序列，且总氨基酸序列数目在90～110之间的其他噬菌体编码的同源蛋白质；序列表SEQ ID NO.4为携带组氨酸标签及连接肽段的T7噬菌体gp5.5蛋白质氨基酸序列，所述蛋白质保守性较高，与其他噬菌体表达的同源蛋白质序列相似性较高。本发明通过高通量测序首次确证gp5.5蛋白质能结合大肠杆菌细胞内所有种类tRNA，且特异性极高。依赖gp5.5蛋白质分离纯化大肠杆菌总tRNA方法，利用了天然生物大分子相互作用特性，本发明方法快捷方便，无需传统繁琐纯化步骤，得到tRNA纯度显著提高，优势明显。

技术领域

本发明属于微生物核酸代谢相关蛋白质研究领域，具体涉及一种基于gp5.5蛋白质的大肠杆菌总tRNA纯化方法。

背景技术

tRNA(转运核糖核酸)是所有生物遗传信息传递和表达最重要的一类核酸分子。tRNA作为连接遗传信息和对应氨基酸之间的“接头分子”，是蛋白质合成中的关键生物大分子之一，一般由76-90个核苷酸组成类似三叶草结构(Plescia et al.，1965；Sharp etal.，1985)。同时tRNA在生物体内也扮演着多种多样的调控角色，一种tRNA只能携带一种氨基酸，如丙氨酸tRNA只携带丙氨酸，但一种氨基酸可由不止一种tRNA携带。同一生物中，携带同一种氨基酸的不同tRNA称作“同功受体tRNA”。组成蛋白质的氨基酸有20种，而tRNA可以有六七十种或更多。携带同一种氨基酸的细胞器tRNA与细胞质tRNA也不一样。生物体发生突变后，校正机制之一是通过校正基因合成一类校正tRNA，以维持翻译作用译码的相对正确性。在蛋白质翻译过程中，tRNA主要是携带氨基酸进入核糖体，在mRNA指导下合成蛋白质(Crick et al.，1968)。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成(Miller et al.，2003)；作为某些酶的抑制剂等(Yamasaki et al.，2009)。在许多植物病毒RNA分子中发现有类似于tRNA的三叶草结构，有的也能接受氨基酸，其功能不详。tRNA分子成熟过程中存在大量的单核苷酸化学修饰，在甲基转移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA，G→mA；有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶；某些腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸等。这些特别的修饰碱基会影响tRNA与核糖体的相互作用，有时这些事件发生在反密码子位点，从而改变tRNA与mRNA密码子的碱基配对特性(Stryer et al.，2002)。近期的一些研究提出了从前没有预料到的一个新观点：tRNAs并不总是最终产物；它们还是一些小分子RNA的源头(Gebetsbergeret al.，2013；Shigematsu et al.，2014)。

2015年Goodarzi H发现tRNA的小片段遗传物质可以减少乳腺癌细胞的生长和扩散，研究者发现当乳腺癌细胞暴露于低氧水平下时就可以产生tRNA碎片，而且携带越多tRNA碎片的癌细胞越不容易发生转移(Goodarzi et al.，2016)。研究者表示，来自于特殊tRNAs(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸及酪氨酸)的tRNA碎片可以结合到对癌细胞生命周期尤为重要的癌基因上，从而降低癌细胞生长和转移的能力，研究人员或可开发出一类特殊的核酸分子(tRNA碎片)来抑制肿瘤的生长。此外，研究发现tRNA的转录后修饰与人类疾病息息相关，如2型糖尿病(type 2diabetes，T2D)的致病基因cdka11是一种tRNA甲硫基转移酶，负责tRNA-Lys的修饰，cdka11基因敲除后导致tRNA-Lys无法正确修饰，造成胰岛素前体在蛋白质翻译过程中发生错配，最终导致胰岛素错误折叠，胰岛素功能紊乱而发病(Wei etal.，2011)。