[发明专利]人血白蛋白分子大小分布超高效液相色谱测定方法

说明书

本发明公开了一种人血白蛋白分子大小分布超高效液相色谱测定方法，所述方法包括用超高效液相色谱测定人血白蛋白分子大小分布的步骤，在超高效液相色谱分析中采用ACQUITY UPLC PROTEIN BEH SEC Column、粒度1.7μm、柱长150mm、柱直径的色谱柱，柱温为室温，采用流动相为0.2mol·L^‑1、流速0.6ml·min^‑1的PBS缓冲液，使用Waters UPLC TUV紫外检测器280nm采集数据，样品进样体积10μl，强洗针液体积200μl，弱洗针液体积600μl，定量环可选项partial loop with needle overfill。本研究建立的UPLC人血白蛋白分子大小分布测定方法相比于原HPLC方法检测速度提高了10倍以上，色谱响应提高了5倍以上；UPLC法测定人血白蛋白产品的多聚体含量快速简便、重复性好；UPLC方法有助于实现高通量的人血白蛋白多聚体测定，大幅提高人血白蛋白检验效率。

技术领域

本发明涉及人血白蛋白测定技术领域，尤其涉及一种人血白蛋白分子大小分布超高效液相色谱测定方法。

背景技术

人血白蛋白中多聚体主要出现在巴氏病毒灭活工艺以后，随着60℃加温10小时病毒灭活步骤的完成，小部分白蛋白在加温后自身形成多聚体，还有小部分与存在的杂蛋白聚合形成多聚体，即除了巴氏病毒灭活影响因素外，白蛋白的纯度也会影响多聚体含量。人血白蛋白主要用于治疗多种原因造成的低蛋白血症、失血创伤或烧伤引起的休克等。国家药品监督管理局2018年发布新版批签发管理办法规定，无论国产或进口血液制品均需进行批签发，即药品检验和摘要审核合格获得批签发证明后方可进行上市销售。2015年版《中国药典》三部、经批准的进口药品注册标准或国家药品标准中均规定要对人血白蛋白的多聚体含量进行检测，其含量应符合批准要求。最近2015年～2017年人血白蛋白签发数量分别为2415、2648、2879批次，申报数量庞大且逐年上升。

国外包括欧洲药典、英国药典、中国药典均要求对人血白蛋白多聚体含量进行控制，以防止多聚体含量增高引发的副反应。目前法定检验方法例如2015年版《中国药典》及国外药典包括《欧洲药典》、《英国药典》等人血白蛋白多聚体测定方法是传统的HPLC方法，分析过程需要至少60分钟，这对于逐年递增人血白蛋白出厂放行以及批签发检验的时限要求产生冲突，检验时间成本高的弊病开始凸显，因此特别需要建立快速、准确、重复性好的新检验方法。

发明内容

基于以上现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人血白蛋白分子大小分布超高效液相色谱测定方法，依据分子排阻机理建立超高效液相色谱方法测定人血白蛋白分子大小分布，实现多聚体含量快速、高通量测定。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现：本发明提供一种人血白蛋白分子大小分布超高效液相色谱测定方法，所述方法包括用超高效液相色谱测定人血白蛋白分子大小分布的步骤。

其中，在超高效液相色谱分析中采用ACQUITY UPLC PROTEIN BEH SEC Column、粒度1.7μm、柱长150mm、柱直径4.6mm的色谱柱，柱温为室温；采用流动相为0.2mol·L^-1、流速0.6ml·min^-1的PBS缓冲液；使用Waters UPLC TUV紫外检测器280nm采集数据；样品进样体积10μl，强洗针液体积200μl，弱洗针液体积600μl，定量环可选项partialloop with needle overfill。

进一步地，该方法还包括样品溶液和参考品溶液的制备步骤：