[发明专利]一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用

说明书

本发明公开一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用，利用同源重组和一步法无缝克隆敲除大肠杆菌Nissle1917必需基因dapA基因，获得大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA，克隆dapA基因，构建营养缺陷株互补质粒pMalc2x‑dapA，将所述互补质粒pMalc2x‑dapA电击转化到所述Nissle1917ΔdapA菌株中，用同源重组替换pMalc2x载体上氨苄青霉素抗性基因ampR，获得无抗生素抗性标记的质粒平衡系统，体外合成sall4氨基端12个氨基酸多肽序列基因，并在N端融合胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酶pelB信号肽基因序列，在C端加上His蛋白标签基因序列，一起克隆入互补质粒pMalc2x‑dapA，获得外源药物表达质粒pMalc2x‑dapA‑sall4，将该质粒导入大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA，获得的菌株能有效表达sall4多肽，在肝癌治疗上有显著效果。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及应用。

背景技术

肝脏是肠癌、乳腺癌、胰腺癌等转移瘤发生的主要部位，肿瘤的转移性扩散，可引起90％癌症死亡，而肝转移瘤由于体积小且数量多，对临床治疗上提出了很大挑战。由于肿瘤部位的微环境发生变化，且免疫屏障受损，加上腐坏的肿瘤中心营养过剩，微生物通常会在此聚集繁殖。虽然人们过去也使用过细菌进行癌症治疗，但都是直接将高浓度细菌注射到血液系统中，此方法缺乏特异性和针对性，且毒副作用大。益生型大肠杆菌Nissle1917具有安全无毒、肿瘤靶向性高的优点，可以作为体内传递外源抗肿瘤药物的优良载体。构建不含抗生素抗性标记基因的质粒平衡系统，导入外源药物表达载体，构建可分泌表达外源基因的肿瘤靶向工程菌，在体内特异性的表达、传递外源药物达到治疗癌症的目的。期刊《生物工程学报2003.9.19(5)》黄维、曹诚、李平、钟辉、马清钧(通过大肠杆菌thyA染色体-质粒平衡致死系统构建无抗性基因表达载体)一文中介绍了这种方法，但是其菌株基因组除保留必需氨基酸序列外，其余全部敲除。

SALL4为一种癌胚蛋白，在人胚胎肝脏表达，但在成人肝脏中不表达，在肝细胞癌患者和预后恶化患者中，SALL4可在其肝脏中再次表达，SALL4可作为潜在的治疗靶点。SALL4氨基端多肽能够阻断SALL4与核小体重构和组蛋白脱乙酰基酶(NuRD)复合体相互作用，阻断NuRD介导的SALL4再表达。应用SALL4 12-AA肽能够阻滞SALL4的致癌作用，可用于治疗肝细胞癌。

染色体-质粒平衡系统是以营养选择标志基因代替抗性基因的新型质粒载体系统。其宿主菌通常在染色体上带有重要代谢途径的基因突变，因此突变株在基本培养基上不能生长。只有补充相应的外源营养物质或导入携带有野生型基因序列的互补质粒后，才能使其生存。因此在无相应营养物质添加的基本培养基中,互补质粒的导入是缺陷型宿主菌生长的必需条件。目前该系统已广泛应用于不同种属的减毒疫苗的开发研制过程中。CN200310112640.3中介绍了一种非抗性筛选DNA疫苗载体及其构建方法，采用染色体-质粒平衡致死系统代替抗生素抗性基因来作为DNA疫苗扩增的选择性标记，构建新型非抗性筛选DNA疫苗载体，与质粒pVAX1相比，缺失其中的卡那霉素抗性基因，取而代之的是长度为1281bp的鼠伤寒沙门氏菌asd基因，但是在不添加外源物质和无抗生素选择压力下无法保持自身的生理状态，本发明在能维持原生型菌种自身生理状态的同时，还提高了菌种应用中的安全性能和高效性，在应用于制备肝癌治疗药品上具有广泛的前景。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用。