[发明专利]基于外周血游离核苷酸miRNAs超灵敏检测装置的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及基于外周血游离核苷酸miRNAs超灵敏检测装置的试剂盒及其检测方法，试剂盒含有1)微阵列检测池；2)外接磁场；3)预混合反应液A和4)预混合反应液B，检测多个待测靶标物时，平行配置分别对应检测一种待测靶标物预混合反应液A，分别记为预混合反应液A1、预混合反应液A2；该试剂盒明结合生物分子诊断、纳磁微球富集及生物芯片技术，发展一种新型无需扩增、高灵敏度、高通量直接准确检测与恶性肿瘤的发生、发展及耐药高度相关的外周血miRNAs的技术方法。本发明将在医学肿瘤无创检测、个体化用药及化疗预后生存等方面具有重要价值。

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及基于外周血游离核苷酸miRNAs超灵敏检测装置的试剂盒，还涉及利用该试剂盒的检测方法。

背景技术

微小RNA(miRNA)是一类内源性长约21-25bp的单链短小分子RNA，通过调控基因调节细胞生长、凋亡和信号传导。miRNA多态性与药物代谢和耐药密切相关，异常表达miRNA对预测肿瘤的发生、发展及药物敏感性有重要作用；目前外周血中存在着稳定的miRNA，可作为灵敏度高和特异性强的生物标志物。

目前，外周血miRNA主要的检测方法有克隆测序、Real-Time PCR、RNA印迹杂交、芯片等；微量外周血miRNA通常需要通过扩增进行检测，但由于miRNA序列较短，普通PCR难以进行，虽然目前已有基于茎-环(stem-loop)及基于polyA加尾的Real-Time PCR等，但这些特殊扩增技术难度高不易普及应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于外周血游离核苷酸miRNAs超灵敏检测装置的试剂盒；还涉及利用该试剂盒的检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种基于外周血游离核苷酸miRNAs超灵敏检测装置的试剂盒，包括1)微阵列检测池、2)与检测池底部结构匹配的外接磁力板、3)预混合反应液A和4)预混合反应液B。

优选的，所述微阵列为N*N排列，其中N大于或等于2。

更优选的，所述检测池底部为“V”形。

优选的，所述外接磁力板与微阵列检测池离合式连接。

更优选的，所述预混合液A为与纳米磁珠经过基团偶联的多环链接荧光发夹探针；所述预混合反应液B为TNE缓冲液，由Tris、EDTA、NaCl组成，缓冲液pH为8.0。

优选的，所述预混合反应液A含有一种检测靶标物的探针，检测多个待测靶标物时，平行配置分别对应检测一种待测靶标物预混合反应液，分别记为预混合反应液A1、预混合反应液A2。

所述荧光发夹探针为与miRNA-150特异性结合的双环连接的探针，探针序列如下：

D1：FAM-cgcgattctcccaacccttgtaccagtgatcgcgtgagcacatgaaatacactggagaatcg-BHQ1(SEQ ID NO.1)

D2：FAM-atgcgctctcccaacccttgtaccagtggcgcatcgattctccagtgtacaatcccacagtg-NH2(SEQ ID NO.2)

D3：cactgtgggattgtatttcatgtgctca-BHQ1(SEQ ID NO.3)。

2.利用所述的试剂盒检测外周血游离核苷酸miRNAs的方法，包括如下步骤

(1)将预混合液滴入检测装置的检测池中；

(2)将待测生物样品点入检测池内，与预混合反应液A和预混合反应液B混合均匀，每个样品设置3个重复；