[发明专利]一种免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法及应用，分别构建大鼠Rag1基因第2外显子、Rag2基因第3外显子、Il2rg基因第1外显子的sgRNA的表达载体，通过体外转录表达，获得同时敲除了Rag1基因和Rag2基因的大鼠，获得Il2rg基因被敲除的大鼠，杂交获得Rag1、Rag2和Il2rg基因均被敲除的大鼠。本发明方法构建的大鼠SD‑RG具有免疫缺陷的表型，方便进行多种肿瘤的移植，并支持其快速生长，可以广泛应用于人源化动物模型、干细胞和肿瘤研究等多种领域。

技术领域

本发明属于动物基因工程和遗传修饰领域，尤其是涉及一种基于基因敲除技术的免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法及应用。

背景技术

人源化动物模型体内重建了人源免疫系统，能够更好的模拟人体肿瘤微环境，在肿瘤的在体研究中越来越受到重视。目前，人源化小鼠模型已经应用在新型抗癌药物的筛选以及治疗方法(如细胞治疗和抗体治疗)的探索等各方面。在小鼠中敲除重组活性基因(Recombination Activation Genes，Rag1或Rag2)能够导致T细胞受体和B细胞的免疫球蛋白编码基因区域的基因重组的障碍，造成小鼠的严重免疫缺陷表型Il2rg基因编码一种跨膜蛋白，是几种白介素受体复合物的共同亚基，在免疫细胞分化和功能中起重要作用。敲除Il2rg基因能够清除小鼠体内的NK细胞，因此在建立免疫缺陷动物模型方面有着重要的作用。通过移植人胎儿胸腺、淋巴结、脾脏的同时从尾静脉注射胎儿肝脏细胞，或者移植造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)，能够建立人源化小鼠模型。已知Rag和Il2rg基因敲除品系小鼠提高了人源组织和细胞的移植效率，成功在小鼠体内分化出了不同亚型的造血细胞，包括T、B淋巴细胞、髓系的巨噬细胞、树突状细胞和血小板、红细胞等。

虽然人源化小鼠模型在研究肿瘤药物中已经得到较广泛的应用，但其局限性也是明显的。小鼠的体型小，血液量少；而且受到伦理学的限制，在PDX模型中肿瘤的大小不能超过动物体重的十分之一。如果采用与人类更加接近的大型哺乳动物甚至非人灵长类动物，研究成本又将无法有效控制，因此也不现实。大鼠的体型(体重)是小鼠10倍，所以能够提供更多的样品，而且大鼠的生理结构比小鼠更接近人类。因此，大鼠模型在相关研究中要比小鼠具有更大的优势。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法及应用。本发明通过CRISPR/Cas9技术构建大鼠Rag1基因第2外显子、Rag2基因第3外显子、Il2rg基因第1外显子的sgRNA的表达载体，通过体外转录表达，分别获得同时敲除了Rag1基因和Rag2基因的大鼠以及Il2rg基因被敲除的大鼠，然后通过杂交继而获得Rag1、Rag2和Il2rg基因均被敲除的大鼠。

本发明提出了一种免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)分别构建特异性靶向大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA的表达载体、Rag2基因第3外显子的sgRNA的表达载体、Il2rg基因第1外显子的sgRNA的表达载体；

(2)通过体外转录分别表达得到大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA、Rag2基因第3外显子的sgRNA、Il2rg基因第1外显子的sgRNA、以及Cas9 mRNA；

(3)将大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA、Rag2基因第3外显子的sgRNA和Cas9mRNA分别纯化后，混合，注射入大鼠受精卵细胞中，移植入大鼠输卵管中，获得同时敲除了Rag1基因和Rag2基因的大鼠；

将大鼠Il2rg基因第1外显子的sgRNA和Cas9 mRNA分别纯化后，混合，注射入大鼠受精卵细胞中，移植入大鼠输卵管中，获得Il2rg基因被敲除的大鼠；

(4)通过将步骤(3)得到的同时敲除Rag1和Rag2基因的大鼠和Il2rg基因被敲除的大鼠进行杂交，获得Rag1、Rag2和Il2rg基因均被敲除的大鼠即命名为免疫缺陷大鼠动物模型SD-RG。