[发明专利]一种检测CART细胞针对靶抗原细胞因子的分泌的方法

说明书

本发明涉及体外检测嵌合抗原受体T细胞分泌肿瘤特异性细胞因子的方法。所述方法包括：1)CD19抗原蛋白生物素化；2)将生物素的CD19抗原蛋白固定到磁珠上；3)CART细胞的形成；4)酶联免疫斑点检测CART细胞针对CD19抗原刺激所分泌细胞因子INF‑γ的能力。本发明可以检测CD19CART细胞的体外表达情况，计算方法简便，且灵敏度高，可以高通量的操作，便于实际操作。

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，具体用ELISPOT方法检测体外CART细胞针对靶抗原细胞因子的表达。

背景技术

ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay，其技术原理与ELISA 相似。其实验是在底部有PVDF膜的96孔板上进行的，PVDF膜上包被特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中使用的抗体，该抗体需要无毒，无内毒素，高亲和力等特点。随后，在培养板的孔中加入细胞培养基，待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。

在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，T细胞就会分泌各种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。在洗去细胞后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的二抗结合，然后酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联染色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞。统计膜上的斑点数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的百分比。

免疫系统的细胞功能检测，一直是生物学技术的一个难点。而酶联免疫斑点(ELISPOT)实验的采用，克服了这一难点。酶联免疫斑点实验具有极高的灵敏度，在十万个免疫细胞中，只要有一个激活态的细胞，即可检测出来。同时，操作简单，结果稳定性好，以及可以高通量的检测等。由于具有这些明显的优点，使得酶联免疫斑点(ELISPOT)成为了检测免疫细胞功能的公认的实验方法。

本发明采用酶联免疫斑点技术来检测体外培养的CART细胞针对靶抗原 CD19的INF-γ分泌能力，本发明可以用来监测临床上是否存在针对目标抗原的特异性的CART细胞以及其分泌INF-γ的能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种ELISPOT检测方法，检测CD19CART细胞针对靶抗原CD19阳性蛋白或细胞刺激后INF-γ分泌情况。

ELISPOT检测INF-γ分泌，包括以下步骤：

A准备酶联免疫斑点板子(需要无菌条件)

1.使用无菌的pH7.4的无钙镁离子的1×PBS(0.22μm滤器过滤)稀释包被抗体(INF-γ：1mg/ml)至15μg/ml(1.5μg/100μl)(来自试剂盒)。

2.取出Millipore 96-孔PVDF ELISPOT板子(MSIPS4510)，每孔加入15μl 70％乙醇处理2min。

3.无菌水(0.22μm滤器过滤)清洗板子5遍，每次每孔加入200μl。

4.每孔加入100μl步骤1稀释的INF-γ抗体溶液，4-8℃孵育过夜。

第2天

B在板子中培养细胞(需要无菌条件)

5.准备细胞：

取实施例3中制备的细胞，复苏后计数，然后在37℃，5％CO2条件下使得细胞恢复以达到一个较高的密度。(50ml离心管中，完全的培养基中，5ml， 2×10⁶/ml细胞悬浮液。)

6.准备刺激物

酶联免疫斑点实验应该有的对照：

对照1：只有PBMC细胞+没有磁珠组