[发明专利]阿尼芬净前体的制备方法

说明书

本发明公开了一种全新的棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的方法。该方法将交联酶聚体技术应用于棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的过程中。该方法为通过将脱酰酶制备成脱酰酶交联酶聚体，该交联酶聚体将棘白菌素B转化为棘白菌素B母核。通过该方法，摩尔转化率能达到85％～90％，同时简化生产过程，降低了成本。

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及抗真菌的发酵半合成药物前体的制备，更具体涉及阿尼芬净前体棘白菌素B母核的制备。

背景技术

近年来，由于免疫低下患者逐年增多，真菌感染发病率明显升高，尤其是深部真菌感染的发病率和病死率显著增加。棘白菌素类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，从而达到抗真菌的目的。与传统抗真菌药物相比，该类药物具有作用机制独特，毒副作用低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性，是目前临床治疗深部真菌感染的常用药物。FDA已批准上市的这类药物包括卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungin)和阿尼芬净(Anidulafungin)。

阿尼芬净的制备过程包括以下三步：(1)构巢曲霉(Aspergilus nidulans)发酵产生棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)；(2)通过微生物转化——游动放线菌发酵产生的脱酰化酶对棘白菌素B进行催化，使侧链断裂，生成阿尼芬净的前体-棘白菌素B母核(Echinocandin B Nucleus，ECBN)；(3)在母核的基础上采用化学修饰的方法加入新的侧链——戊氧-三苯羧基。其中前体母核的制备是关键步骤。目前对于ECB母核的制备，化学方法成本较高，微生物转化具有以下优点：反应条件温和、产物单一、高度的化学选择性、区域选择性和对映体选择性、易于纯化、不污染环境且能完成一些化学合成难以进行的反应。

美国专利US7785826B2披露了ECB转化ECBN的工艺。此工艺主要流程包括：将ECB发酵完成以后，离心获得菌丝体，把菌丝体重新悬浮于水中然后加入脱酰酶进行转化，ECB脱酰酶仅利用一次。但该方法操作较为繁琐，工艺转化耗时20～30h，且转化率低，摩尔转化率仅为30％。

CN102618606公开了一种利用放线菌全细胞或发酵液作为催化剂的棘白菌素生物转化方法。该方法在转化体系添加了一种助溶剂，提高底物在转化体系中的溶解度，该助溶剂为β-环糊精或其衍生物，该方法的优点是提高了转化速度和转化率，缺点是全细胞转化，体系中带有大量菌体，酶与底物接触效率不高，后续分离纯化步骤复杂成本较高，没有解决酶在含有机溶剂体系中易失活的问题。

CN103074403公开了一种将ECB转化为ECBN的方法，涉及发酵完成后通过加磷酸盐、超声、离心、旋蒸浓缩，得到棘白菌素B脱酰酶酶液，然后加入ECB底物进行转化。该方法不足之处在于粗酶提取过程繁琐，不利于工业化放大生产；使用旋蒸的方式提取粗酶，由于温度偏高，易造成蛋白质变性，脱酰酶的活力有负面影响。

CN103374593公开了一种在发酵过程中添加棘白菌素B底物转化为棘白菌素B母核的方法，该方法将底物添加到脱酰酶产生菌发酵液中转化，反应体系存在大量微生物，后续分离纯化步骤复杂，成本高。

CN103387975公开了一种固定化环脂肽酰基转移酶的制备方法，所述环脂肽酰基转移酶固定于载体上；所述环脂肽酰基转移酶来源于天然或人工突变体、或者变种及由通过导入外来的环状酰基转移酶基因后转化得到的。利用固定化环脂肽酰基转移酶将ECBN转化为阿尼芬净。通过该方法，虽然转化率较高，但操作复杂，成本较高，固定化过程的化学反应容易导致酶部分失活。

CN105648000公开了一种棘白菌素B微生物酶转化方法，具体涉及棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的方法。包括在微生物发酵生成棘白菌素B脱酰酶后提取粗酶，然后通过分批添加粗酶及棘白菌素B的方式进行转化，该方法分批添加粗酶和底物进行转化，没有解决酶暴露在有机溶剂体系中容易失活的问题。