[发明专利]一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用

说明书

本发明涉及一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用。所述CpG甲基化位点在外周血白细胞DAZ3基因启动子区。所述试剂盒包括检测上述甲基化位点的定量PCR引物。在本发明中，外周血白细胞较易获得，无需其他组织，属于无创性检查；外周血白细胞DAZ3基因启动子区甲基化反映的是机体整体的病理、生理情况，以其作为突发性弱精辅助诊断的生物标志物可以提高检测的准确性；所述试剂盒简化了定量PCR引物库，减少制作成本和生产时间，增加了针对性和实用性，提高了检测的灵敏度和特异性；所述标志物、方法、试剂盒能够用于突发性弱精辅助诊断。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用。

背景技术

引起男性弱精症的因素复杂，有遗传因素、生殖道感染及精索静脉曲张等，其中遗传缺陷是引起男性无精及弱精症的重要原因之一。染色体数量或者结构异常可以引起男性生殖器官异常，影响精子的发生进而降低其生育能力。本病以克氏综合征多见，核型为47，XXY。发病机制是X染色体在减数分裂时不分离，导致患者睾丸小而质硬，睾酮合成功能低下，发生严重弱精或无精子症。

突发性弱精属弱精症的一种，但其病因尚不明确。患有突发性弱精的男性临床表现为生殖器官结构和功能均正常，可正常排精，精液常规检查除了精子活力低下这一项，其余指标均在参考范围内。研究表明， Y染色体长臂上AZF(azoospermia factor)基因与男性不育密切相关。AZF划分为AZFa、AZFb、AZFc 3 个相互独立的区域，这些区域包括一些影响男胚细胞发育和维持的基因和基因家族，会影响精子的发生。 Reijo利用Y染色体特异性DNA探针发现了成人睾丸组织转录编码一种与减数分裂相关的RNA结合蛋白的基因DAZ(deleted in azoospermia)，它恰恰在AZFc区域中。该基因在减数分裂前期的生殖细胞，尤其是精原细胞，发育中的各期精子细胞以及精子尾部均有表达，提示其在精子发生的各期均有调控作用。

临床实验室通过G显带技术对患者的染色体进行检测。操作人员将中期染色体制片经胰酶处理后，再用吉姆萨进行染色，得到染色体区带。然而，G显带技术只能显示染色体带的位置、宽度和深浅等，无法对染色体结构进行更细微的分辨。而患有突发性弱精的男性其染色体检测结果是正常的。其他对突发性弱精的主要检查手段有精液常规、激素检测、B超等。但这些均为疾病排除性检测，不可辅助诊断。近年来，随着分子生物技术的不断发展，利用荧光原位杂交技术，将荧光素标记的探针进行染色体核型特定位点的检测和标记，可以精确地检测染色体上DNA链单个碱基的突变/缺失，从而大大提高染色体核型分析的精度。比如Mozdarani推荐的PRINS和FISH两种技术相结合方法对精子胞核中DAZ基因微缺失进行筛查检测，但由于其处理程序繁琐，对实验人员操作技术要求高，因而未在临床上推广应用。当前，尚没有利用无创伤性、取材方便的血液样本检测与突发性弱精辅助诊断的生物标志物相关的特异性定量PCR引物及检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一个用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点。

本发明的另一目的是提供一种用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点定量PCR引物。

本发明的又一目的是提供所述的CpG甲基化位点或其定量PCR引物的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一个用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点，该CpG位点在外周血白细胞DAZ3基因启动子区；所述的DAZ3基因启动子区CpG位点位置为：-312～-313。

上述定量PCR引物的筛选方法包括以下步骤(见图1)：

(1)分别收集17例有子嗣的健康男性和13例年龄相匹配的患有突发性弱精男性的EDTA抗凝全血样本，提取总DNA；