[发明专利]基于CRISPR的基因组修饰和调控

权利要求书

1.用于修饰真核细胞中的染色体序列的方法，所述方法包括：

a) 向真核细胞引入两种RNA指导的切口酶系统或编码所述系统的核酸，和任选供体多核苷酸，其中各RNA指导的切口酶系统包含

(i)经修饰以剪切双链序列的一条链的RNA指导的核酸内切酶；和

(ii)指导RNA，其包含与染色体序列中的靶位点具有互补性的第一区域和与RNA指导的核酸内切酶相互作用的第二区域，

其中各靶位点紧接着原间隔毗连基序(PAM)，并且两种RNA指导的核酸内切酶的靶位点在染色体序列的相对链上；和

b)培养所述真核细胞使得两种RNA指导的核酸内切酶足够靠近剪切染色体序列的相对链，以在染色体序列中引入双链断裂，并且所述双链断裂通过DNA修复过程修复使得所述染色体序列被修饰，其中

所述方法不包括用于修饰人类的种系遗传身份的过程和，其中

所述方法不包括用于治疗人或动物身体的方法。

2.用于修饰真核细胞中的染色体序列的离体或体外方法，所述方法包括：

a) 向真核细胞引入两种RNA指导的切口酶系统或编码所述系统的核酸，和任选供体多核苷酸，其中各RNA指导的切口酶系统包含

(i)经修饰以剪切双链序列的一条链的RNA指导的核酸内切酶；和

(ii)指导RNA，其包含与染色体序列中的靶位点具有互补性的第一区域和与RNA指导的核酸内切酶相互作用的第二区域，

其中各靶位点紧接着原间隔毗连基序(PAM)，并且两种RNA指导的核酸内切酶的靶位点在染色体序列的相对链上；和

b)培养所述真核细胞使得两种RNA指导的核酸内切酶足够靠近剪切染色体序列的相对链，以在染色体序列中引入双链断裂，并且所述双链断裂通过DNA修复过程修复使得所述染色体序列被修饰，其中

所述方法不包括用于修饰人类的种系遗传身份的过程。

3.权利要求1或2的方法，其中各RNA指导的核酸内切酶衍生自成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas) (CRISPR/Cas)类型II系统蛋白。

4.权利要求3的方法，其中所述CRISPR/Cas类型II系统蛋白是Cas9蛋白。

5.权利要求4的方法，其中所述Cas9蛋白包含RuvC或HNH结构域中的突变。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中各RNA指导的核酸内切酶进一步包含至少一个选自核定位信号、细胞穿透结构域或标志物结构域的另外的结构域。

7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述靶位点是Rosa26基因座、HPRT基因座或AAVS1基因座。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述供体多核苷酸包含供体序列，所述供体序列相对于染色体序列中的靶位点附近的染色体序列具有至少一个核苷酸改变。

9.权利要求8的方法，其中所述供体序列侧接与位于染色体序列中靶位点上游和下游的序列具有基本序列同一性的序列。

10.权利要求8或9的方法，其中所述供体序列侧接与由RNA指导的核酸内切酶生成的突出端相容的短突出端。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中编码各RNA指导的核酸内切酶的核酸是mRNA，和编码各指导RNA的核酸是DNA。

12.权利要求1-10中任一项的方法，其中编码各RNA指导的核酸内切酶的核酸是DNA，和编码各指导RNA的核酸是DNA。

13.权利要求12的方法，其中所述DNA是载体的一部分，所述载体进一步包含与编码RNA指导的核酸内切酶的核酸可操作连接的启动子控制序列和与编码指导RNA的核酸可操作连接的启动子控制序列。