[发明专利]一种检测香豆素的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

本发明提供一种检测香豆素的酶联免疫试剂盒及其应用。该试剂盒包括：包被有包被原的酶标板、香豆素标准品溶液、酶标二抗、香豆素特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；所述包被原为香豆素偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体，所述香豆素特异性抗体是以香豆素偶联抗原作为免疫原制备获得；所述香豆素偶联抗原是由香豆素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述香豆素半抗原是由香豆素进行缩醛反应得到。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测烟草及烟用香精香料中香豆素的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测香豆素的酶联免疫试剂盒及其应用，可定性、定量检测烟草及烟草制品、烟用香精香料中香豆素的残留量。

技术背景

香豆素系化合物是一类具有芳香气味，母核为苯并α-吡喃酮结构的天然产物，广泛分布于植物界，根据结构可分为简单香豆素系化合物、呋喃香豆素系化合物、吡喃香豆素系化合物和其他香豆素系化合物等。香豆素（coumarin）又名邻羟基桂酸内酯和1,2-苯并吡喃酮，是一种天然植物次生产品，是广泛存在于自然界中的一种内酯类化合物，于1820年发现于黑香豆中，主要以游离状态和苷的形式存在于植物中, 在芸香科和伞形科植物中最多，其次存在于豆科、兰科、木樨科、茄科和菊科植物，少数来自微生物。香豆素作为一种重要的香料，常用作定香剂、脱臭剂，配制香水和香料，也用作饮料、食品、卷烟、塑料制品、橡胶制品等的增香剂，医药上将其加入药剂中作为矫味剂。实验发现，香豆素对小鼠胚胎有毒性，能引起痛觉消失，使中性胆碱酯酶发生变化，对大鼠为可疑致肿瘤物。香豆素在体内的含量达到一定量时具有生理毒性，通过长期的动物实验发现其具有肝毒性，主要是由代谢的途径导致P450（细胞色素P）及其依赖性酶的减少引起的。由于香豆素的潜在的不良反应，美国食品药品管理局（FDA）早在1954年就禁止将香豆素用作食品添加剂；欧洲食品安全局（EFSA）规定香豆素的每日耐受摄入量（TDI）为0.1 mg/kg bw；欧盟规定，对于洗去型化妆品，香豆素的含量不得超过30 μg/g，对于非洗去型化妆品，香豆素含量不得高于10 μg/g；2010年7月，台湾地区食品管理机构发布通知禁止在食品中添加香豆素，同时规定“惟饮料中因使用天然香料，导致天然香料本身含香豆素残留时，其含量仍应在2.0 mg/kg以下”。

烟用香精香料在生产制造过程中有可能由天然植物精油引入香豆素，进而通过烟丝中添加的香精香料存在于烟草制品中，对消费者的健康造成潜在危害。因此，建立香豆素的快速检测方法，对香精香料及烟草制品进行质量控制十分必要。

目前，香豆素主要通过直接萃取法、超声萃取法、同时蒸馏萃取法、水蒸气蒸馏法等提取，结合气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）、高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测。仪器分析方法虽可以实现准确定性定量，但需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样品前处理繁琐费时、检测时间长、检测费用高，对于现场检测工作的开展具有局限性。因此，能否提供一种用酶联免疫法测定烟草及烟用香精香料等样品中香豆素残留量的试剂盒，正是本发明的研究重点。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况提供一种检测香豆素的酶联免疫试剂盒及其应用，本发明应用酶联免疫检测技术测定烟草及烟用香精香料中的香豆素，具有高效、准确、简便、经济等特点，适用于现场大量样品的定性和定量检测。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种检测香豆素的酶联免疫试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、香豆素标准品溶液、酶标二抗、香豆素特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为香豆素偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体，所述香豆素特异性抗体是以香豆素偶联抗原作为免疫原制备获得。

所述香豆素偶联抗原是由香豆素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白或人血清白蛋白，所述香豆素半抗原是由香豆素进行缩醛反应得到，其分子结构式为：