[发明专利]一种快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种快速检测牛流行热病毒的RT‑PCR引物及其应用，属于动物细菌学及分子生物学技术领域。所述RT‑PCR引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；上述引物用于制备检测牛流行热病毒的RT‑PCR试剂盒。试剂盒提供的RT‑PCR检测方法实验结果显示，本发明提供的RT‑PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性，重复性好，可信度高，特异性检测出牛流行热病毒，快速准确的获得检测结果，同时价格低廉、操作简便，适合基层使用，可作为牛流行热病毒实验室快速鉴别和大规模流行病学调查的一种快速、准确、简便的检测工具。

技术领域

本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速、简便、低成本检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及试剂盒。

背景技术

牛流行热是由牛流行热病毒（Bovine ephemeral fever virus, BEFV）引起牛的急性、热性的传染疾病。患病动物临床上表现为突然发热、精神沉郁、僵硬、流泪、跛行等。本病有明显的季节性，多发生于雨量多和气候炎热的6月~9月。该病的发病率高达80%，而在无并发症的情况下病死率较低，很少超过2%~3%，但是过度肥胖的牛病死率可高达30%。一般认为本病可经过呼吸道感染以及吸血昆虫的叮咬等进行传播。

Schwinfuth于1867首次在东非报道牛流行热，随后津巴布韦、印度尼西亚、日本等国都有报道。我国是1976年首次分离到BEFV。该病毒为单股负链RNA病毒，属于弹状病毒科，暂时热病毒属。现诊断牛流行热的方法很多，可根据临床症状以及病理变化做出初步诊断，还可以通过ELISA、补体结合试验、中和试验等技术进行诊断，但是这些试验都存在缺点，即反应时间长、材料多、检测时间具有明显的滞后性。而且，血清学诊断方法存在着种间的交叉反应、非特异性反应，极大阻碍了血清学方法的应用，影响检测效果。

然而，RT-PCR这种先进的分子生物学检测手段，不仅可以快速准确的检测病原，而且其检测方法特异性强、敏感性高。由于G蛋白是BEFV主要的免疫原性蛋白，因此，本发明以G基因为靶基因设计特异性引物，建立一种RT-PCR快速检测方法，为早期牛流行热病毒诊断提供一种有效、可行性的诊断方法。

发明内容

针对养牛业健康发展的实际需要，本发明的目的是建立一种低成本、快速、准确地检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

本发明提供一种快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物，所述RT-PCR引物由具有SEQ IDNO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成。

优选的，所述RT-PCR引物是依据牛流行热病毒的G基因进行设计，扩增的目的片段大小为235 bp。

优选的，所述的RT-PCR引物在制备检测牛流行热病毒试剂盒的应用。

本发明还提供一种如以上所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR试剂盒，所述RT-PCR试剂盒包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。

优选的，所述RT-PCR试剂盒还包括10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶、cDNA模板和超纯水。

优选的，所述RT-PCR试剂盒的SEQ ID NO:1引物和SEQ ID NO:2引物使用浓度为25pmol/μL。

优选的，所述的10×PCR Buffer包含KCL 20-30 mM、MgSO₄ 3-10 mM、10-20 mMTris-HCL。