[发明专利]乙酸CoA转移酶缺陷型大肠杆菌工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌及其应用，所述大肠杆菌工程菌构建了由多个基因构成的异丙醇合成途径的工程菌，并通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸CoA转移酶的编码基因获得。本发明提供的异丙醇合成途径由乙酰乙酰基辅酶A合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶A合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶A裂解酶、乙酰乙酸脱羧酶以及二级乙醇脱氢酶组成，并能够实现在生物体内以乙酰辅酶A为起始代谢物向异丙醇的转化。本发明提供的突变体菌株内表达本发明提供的编码组成异丙醇合成代谢途径中所有的酶的基因获得。本发明所构建的重组大肠杆菌菌株在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖或甘油的丰富培养基为原料合成364 mg/L异丙醇。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及乙酸CoA转移酶缺陷型大肠杆菌工程菌及其应用。

背景技术

异丙醇(isopropanol)为一种仲醇。在传统工业中主要用于制药、化妆品、塑料、香料、涂料及电子工业上用作脱水剂及清洗剂。随着当今社会日益增长的能源需求，其在能源方面的应用得到重视和开发。异丙醇既可以被用作生物燃料来部分代替石化汽油，亦可取代甲醇来酯化脂肪和油从而合成生物柴油，也可脱水后生成目前只能从石油中提炼获得的丙烯。

目前异丙醇的生产主要是基于丙烯或丙酮为原料的化工路线。化学合成法工艺较为复杂且常需高温高压，具有高能耗高物耗的特性，增加了其合成成本。另外，化学合成法还会导致严重的环境污染。

传统的生物技术产业已经或正在发生技术上和结构上的重大调整，已向微生物细胞工厂方和高效生物催化为核心的生物炼制技术方向发展，传统的生物工艺逐渐地被高效、低能耗和低污染的绿色工艺和技术所取代。

在自然界中，一些梭菌中天然存在着异丙醇的代谢合成途径。该途径被认为是异丙醇合成的模式途径，起始于乙酰辅酶A经过乙酰乙酸和丙酮，最终合成异丙醇。首先，两分子的乙酰辅酶A在乙酰辅酶A酰基转移酶(ACoAAT)的催化下脱去辅酶A生成一分子乙酰乙酰基辅酶A。其次，生成的乙酰乙酰基辅酶A在乙酰乙酸转移酶(atoD和atoA)的作用下产生乙酰乙酸，并将辅酶A转移至乙酸上再生成乙酰辅酶A。随后，乙酰乙酸被乙酰乙酸脱羧酶(ADC)转化为丙酮和二氧化碳。最终，丙酮在二级乙醇脱氢酶(SADH)的催化下生成异丙醇。该途径已被构建于不同宿主微生物中用于合成异丙醇。但该代谢途径涉及乙酸的富集，理论上这不利于菌体的生长。此外，该途径依赖乙酰乙酸转移酶atoD和atoA催化的乙酰乙酸的合成。然而，乙酰乙酸转移酶更倾向于乙酰乙酸的降解而非合成，不利于代谢产物异丙醇的合成。

发明内容

发明目的：为解决现有技术的不足，本发明设计了一种不涉及乙酸富集以及不依赖乙酰乙酸转移酶atoD和atoA的新的异丙醇合成途径，并引入大肠杆菌，通过敲除大肠杆菌基因组上atoD和atoA基因达到阻断乙酰乙酸降解途径的目的。

本发明所要解决的技术问题是提供了一种乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌在生产异丙醇方面的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种生产异丙醇的方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌构建了由多个基因构成的异丙醇合成途径的工程菌，并通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸CoA转移酶的编码基因获得。

其中，本发明所述由多个基因构成的异丙醇合成途径中的多个基因包含编码乙酰乙酰基辅酶A合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶A合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶A裂解酶、乙酰乙酸脱羧酶以及二级乙醇脱氢酶的基因。

其中，本发明所述大肠杆菌工程菌通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸CoA转移酶的编码基因atoD和atoA获得。