[发明专利]一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的引物、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物；所述正向引物包括如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列中的至少一种；所示反向引物包括如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所示反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

3.一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-2任一所述的引物，还包括与人EGFR基因L858R突变型DNA模板结合的TaqMan MGB突变型探针，以及与人EGFR基因L858R野生型DNA模板结合的TaqMan MGB野生型探针，所述TaqMan MGB突变型探针和TaqMan MGB野生型探针的5’端均带有荧光报告基团，所述TaqManMGB突变型探针和TaqMan MGB野生型探针的3’端均带有小沟结合物MGB与非荧光淬灭基团，所述TaqMan MGB突变型探针5’端带有的荧光报告基团和TaqMan MGB野生型探针5’端带有的荧光报告基团不同。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述TaqMan MGB突变型探针的核苷酸部分含有如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列中的一种，所述TaqMan MGB野生型探针的核苷酸部分含有如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列中的一种。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述TaqMan MGB突变型探针为：5’-FAM-CAGTTTGGCCCGCCCA-MGB-NFQ-3’，所述TaqMan MGB野生型探针为：5’-VIC-CAGTTTGGCCAGCCCA-MGB-NFQ-3’；

或者所述TaqMan MGB突变型探针为：

5’-FAM-TTGGCCCGCCCAAAC-MGB-NFQ-3’，所述TaqMan MGB野生型探针为：5’-VIC-TTGGCCAGCCCAAAC-MGB-NFQ-3’。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR预混液，所述预混液包括dNTPs、Taq酶和PCR缓冲液。

7.一种基于数字PCR检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的方法，其特征在于，所述方法是采用如权利要求1-2任一所述的引物或者如权利要求3-6任一所述的试剂盒来检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)从待检样本中提取基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，加入权利要求3-6任一所述的试剂盒中的正向引物、反向引物、TaqMan MGB突变型探针和TaqMan MGB野生型探针来配制数字PCR扩增反应体系；

(3)将数字PCR反应体系分割成独立反应体系后进行PCR扩增；

(4)使用检测器对独立反应体系的荧光信号进行检测，根据突变型EGFR核酸分子模板的微滴信号检测仪给出的荧光信号与野生型EGFR核酸分子模板的微滴信号检测仪给出的荧光信号不同，以及泊松分布原理，计算出突变型及野生型EGFR分子的浓度或拷贝数，以及突变型EGFR分子占总EGFR分子的比例。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中每20μl数字PCR扩增反应体系包括：PCR预混液10μl、20μM/L正向引物1.8μl、20μM/L反向引物1.8μl、10μM/L TaqManMGB突变型探针0.5μl、10μM/L TaqMan MGB野生型探针0.5μl、模板2μl、ddH₂O 3.4μl。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增的反应程序为：95℃，10分钟1个循环；94℃，30秒变性，60℃，60秒退火、延伸共进行40个循环；98℃，10分钟1个循环；4℃保持。