[发明专利]一种X-SCID慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种X‑SCID慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，其中，所述慢病毒载体还包括IL‑2RγC基因。本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入IL‑2RγC基因，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得IL‑2RγC基因在转基因的相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成X‑SCID基因治疗过程中正常基因的传递。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种X-SCID慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种应用改良后的慢病毒载体优化表达IL-2RΓC基因用于制备治疗异染性脑白质营养不良症的药物。

背景技术

基因治疗(Gene Therapy)是随着各种疾病致病机制理论研究以及基因技术的发展逐渐兴起的新型疾病治疗方式，为从根本上治疗一些由基因缺陷引起的遗传疾病、肿瘤、心脑血管疾病以及一些自身免疫性疾病带来了新的方向与希望。所谓基因治疗是指通过特殊的传递载体操作遗传物质来干预体内疾病的发生、发展，包括替代或纠正生物体自身基因结构或功能上的错乱，杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到疾病治疗目的。目前，基因治疗遗传物质传递方式主要依靠各种病毒载体，包括逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated virus)以及慢病毒(lentivirus)等。

X-SCID(X-linked severe combined immunodeficiency disease)为X连锁严重联合免疫缺陷病的缩写，是编码IL-2RγC的基因突变引起的，是一种细胞免疫缺陷的单基因遗传病，占SCID病的30-40％，该病新生儿的发病十分罕见，比例约为1:50,000-100,000。γc是多种造血细胞因子受体的组成部分，包括IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，IL-15以及IL-21受体，其中IL-7，IL-15受体通路的异常将导致早期T细胞和自然杀伤(NK)细胞的分化受阻，而IL-21受体主要与记忆B细胞的分化与生存息息相关，其功能不能够被其他受体因子所代替。因此，该病病人体内淋巴细胞减少(CD3+/CD4+或CD3+/CD8+细胞)，T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)消失。B细胞数往往正常，但B细胞功能严重损害，3种Ig浓度均低下，甚至缺失。

目前已经发现的导致X-SCID发生的基因突变有264种，主要分布在8个外显子和转录翻译的调控序列中，其中外显子5和外显子3为主要的突变区域，包括有错义突变，无意义突变，插入突变，缺失突变等。临床上表现主要为不能触及浅表淋巴结，无扁桃体，胸腺小且缺乏功能，患儿出现反复的难治性致命性的条件致病菌感染，真菌感染病毒感染以及寄生虫感染。该病常规的治疗方法是在出现严重致命性感染前进行异体干细胞(HSC)移植，但由于配型困难，且移植后很可能出现各种感染，治疗效果不佳。

法国在1999-2000年首先进行了5例X-SCID患儿的基因治疗，应用带有正常基因的MLV作为载体转染了CD34+HSCs，进行自体HSCs移植。其中4例在2年间均有免疫系统重建。但后来有三例患儿出现白血病，其中两例为病毒整合入宿主基因组上，T细胞原癌基因LMO2被激活，另一例是由于逆转录病毒多个位点的随机整合，激活了LMO2在内的四个原癌基因。这是由于MLV病毒插入位点较随机，安全性能差，而慢病毒载体如HIV-1，在多年的临床应用中未发现此类随机插入致癌的问题，其免疫刺激性低，能够在基因治疗领域内有更广阔的应用空间。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种X-SCID慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述X-SCID慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：