[发明专利]玉米叶绿体基因组SSR位点及在品种鉴定中的应用

说明书

本发明提供了玉米叶绿体基因组的SSR位点及在品种鉴定中的应用。本发明通过代表性样品选取、高质量测序数据、精确数据分析保证获得叶绿体多态位点的准确性和高效性，选取来源广泛、表型和基因型丰富的玉米材料，基于拼接的玉米材料叶绿体基因组序列，利用MISA软件搜索SSR，最终确定13个叶绿体SSR多态位点。利用这些SSR位点可以：(1)构建玉米品种叶绿体DNA‑SSR指纹数据库；(2)玉米样本母系溯源分析；(3)玉米样本正反交鉴定。应用本发明的叶绿体SSR位点，能够在基因组水平上拓展了玉米可用标记位点的范围，为玉米品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，细胞质遗传特性等研究提供了新的思路和方法。

技术领域

本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及玉米叶绿体SSR分子标记及其应用。

背景技术

叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，拥有自身完整的一套基因组，称为叶绿体基因组。叶绿体基因组信息由于具有以下优势而被广泛应用于植物品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，系统进化，细胞质遗传特性等研究和应用中。(1)叶绿体基因组较小且相对保守，其全序列容易获得；(2)叶绿体基因组是母系遗传，不同个体间基因的交换和融合很少发生，叶绿体各基因间有很好的共线性；(3)叶绿体基因组除反向重复区外均为单拷贝基因，几乎不存在旁系同源基因干扰；(4)叶绿体编码区与非编码区进化速度差异显著，存在一些高突变区，可以解决种以下分类单元问题。

在玉米品种、育成材料以及种质资源鉴定的研究和应用中，目前均采用玉米的细胞核基因组的遗传信息。如玉米品种鉴定SSR标记法采用40对SSR(simple sequencerepeat)引物(王凤格等，2014)；适于玉米DNA指纹分析的芯片maizeSNP3072(Tian et al.,2015)；商业化玉米芯片产品maizeSNP50K(Ganal et al.,2011)；以及基于高通量测序技术的GBS、简化基因组测序方法等。现有玉米样品分子鉴定方法均是基于玉米细胞核基因组序列信息，植物细胞中除细胞核遗传外，还具有细胞质遗传，即叶绿体和线粒体基因组信息。并且细胞质基因组信息尤其是叶绿体基因组信息具有上述优点，更加适合于玉米样品的母系溯源等鉴定中。现有玉米基因组多态位点集合中未记载有针对于叶绿体基因组开发的SSR多态位点。

发明内容

本发明的目的是提供适用于玉米母系溯源的一套叶绿体SSR分子标记。

为了实现本发明目的，本发明通过收集来源广泛、表型和基因型丰富、代表性强的170份玉米自交系材料，基于高质量的重测序数据开发玉米叶绿体基因组SSR位点组合并阐述了其在玉米样品鉴定中的应用。总体思路和步骤如下。(1)170份玉米代表性试验材料的选取，类型包括我国所有杂种优势群，甜糯、地方品种、CMS不育三种类型样品等。(2)高浓度高质量总DNA制备。(3)基于二代测序平台的高通量测序，构建文库大小为500bp、PE140、测序深度为5倍。(4)全基因组序列数据处理、叶绿体基因组拼接，使用两个软件独立拼接，基于玉米B73叶绿体基因组序列利用BLAST程序筛选属于叶绿体基因组的contig，进行组装，验证序列准确性。(5)叶绿体基因组注释、多态位点确定，利用DOGMA软件注释叶绿体基因组。(6)将170份材料叶绿体基因组序列进行比对，利用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)软件搜索SSR位点，具体筛选指标为单碱基重复次数必须高于10，二碱基重复次数高于8，三碱基重复次数高于5，四碱基重复次数高于4，五碱基重复次数高于3，六碱基重复次数高于3，获得33个SSR位点。(7)在33个SSR位点两侧设计引物，基于荧光毛细管电泳平台验证分析，根据扩增是否成功、是否为单峰、是否为多态等指标进行分析，最后评估确定13个叶绿体SSR多态位点。

所述13个SSR多态位点的物理位置是基于玉米品种B73叶绿体基因组序列比对确定的，所述的13个SSR多态位点编号是CPMSSRP-01到CPMSSRP-13，具体位点信息见表1。本发明13个玉米叶绿体SSR位点开发评估的技术路线图见图1。

表1 13个叶绿体SSR多态位点信息