[发明专利]一种苯并芘免疫原的制备方法及其用途

说明书

本发明公开了一种苯并芘免疫原的制备方法及其用途，包括：先用苯并芘标准品进行亲电取代反应生成6‑碘苯并芘，再通过Heck偶联反应得苯并芘的羰基衍生物BaP＝O即BaP半抗原，然后经肟化反应将BaP半抗原的羰基羧基化，并用活化酯法与牛血清蛋白(BSA)偶联，得BaP免疫原BSA‑BaP；上述合成方法简单、快速，提供了一种制备特异性强的BaP免疫原的新途径，可用于制备BaP人工多克隆抗体及建立苯并芘免疫分析检测方法。

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种苯并芘免疫原的制备方法及其用途。

背景技术

苯并芘(BaP)又称3,4-苯并芘，工业生产和生活过程中煤炭、石油和天然气等燃料不完全燃烧以及食物在熏制、烘烤和煎炸等高温烹调过程中都会产生BaP，具有致癌性、致畸性和致突变性，在环境介质中广泛存在。苯并芘的毒性具有长期和隐匿特性，人体接触或摄入BaP后能够在体内蓄积，在表现出症状前具有较长潜伏期。由于BaP来源广泛，且对人体危害性较大，引起了国内外学者的广泛研究，目前国内外对苯并芘检测的研究多集中于大气、水体等环境介质及粮油、肉类等食品，最常用的检测方法有气相色谱、气相色谱-质谱、高效液相色谱等仪器分析方法。

目前，酶联免疫吸附法(ELISA)用于大批量样品的快速筛查与检测，受到广泛的研究，如Matschulat等制备了BaP单克隆抗体，利用ELISA方法检测了水中BaP的含量，灵敏度IC₅₀为24ng/mL；Pschenitza等利用固相萃取结合ELISA的方法检测食用油中的苯并芘，其检测下限为0.63μg/mg。另外，生物素-亲和素-酶联免疫吸附法(BA-ELISA)等高灵敏度的免疫检测技术不断兴起，是一种将抗原抗体间的特异性识别免疫反应与酶的高效催化性能以及生物素-亲和素系统结合在一起而发展起来的非均相免疫分析技术，即将抗体或抗原生物素化，利用固相包覆的抗原或抗体专一、特异性的识别结合，再利用链酶亲和素偶联生物素化抗体，最后通过酶来催化小分子底物产生肉眼可辨别的颜色变化，由于固相载体上结合的酶量与待测物的量呈现一定的量比关系，可实现定性或定量分析。在BA-ELISA方法中，一个亲和素分子上的4个亚单位都能分别专一特异性的识别结合一个生物素分子，亲和常数高达1015mol/L，提高被固相结合的酶数量，减少与试剂间的非特异性识别反应，提高检测方法的灵敏度。

上述免疫分析方法均是基于抗原抗体间的特异性识别免疫反应的检测技术，BaP免疫原的制备是建立检测BaP免疫分析技术的基础，BaP分子不含能够与蛋白质偶联的活性官能基质，需要在BaP小分子上引入活性官能团，以便与载体蛋白偶联如氨基、羧基、羰基等。目前关于BaP免疫原的制备方法报道较少，且存在操作复杂、产率较低或所需设备要求较高，有关BaP免疫原制备方法种类较少且单一。

发明内容

本发明的发明人在前期研究的基础上发现，先用苯并芘标准品进行亲电取代反应生成6-碘苯并芘，再通过Heck偶联反应得BaP半抗原即苯并芘的羰基衍生物BaP＝O，然后经肟化反应将BaP半抗原的羰基羧基化，并用活化酯法与牛血清蛋白(BSA)偶联，得BaP免疫原BSA-BaP。本发明提供了一种制备特异性强的BaP免疫原的新途径，合成方法简单、快速，可用于制备BaP人工多克隆抗体及建立苯并芘的免疫分析检测方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种苯并芘免疫原，结构式如式(Ⅰ)所示，

本发明的第二方面，上述苯并芘免疫原的制备方法，合成路线如式(Ⅱ)所示，

具体地，包括以下步骤：

(1)用苯并芘标准品进行碘代反应，在室温下反应48h得中间产物6-碘苯并芘，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:25(v/v)的薄层色谱监测上述反应至原料消失为止；