[发明专利]能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列及其应用

说明书

本发明公开了能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列，并证明了该序列能够用于在农杆菌中直接实现重组克隆的筛选。农杆菌是植物转化系统重要宿主菌，但是构建的重组克隆需要在大肠杆菌中筛选之后转入农杆菌。本发明发现了大豆花叶病毒株系SC15具有抑制农杆菌生长的特性，而株系SC3和SC7没有同样的效果；通过病毒序列截短实验，本发明鉴定出SC15中农杆菌生长抑制相关的序列SC15P；通过利用该序列构建与gateway克隆系统兼容载体并进行LR反应及转化实验，最终本发明实现了利用SC15P直接在农杆菌中进行重组克隆的设想。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列及其应用。

背景技术

农杆菌属于细菌界变形菌门根瘤菌目根瘤菌科，是一种革兰氏阴性菌。农杆菌能够将自身的一段DNA序列转移并插入到植物的DNA中，这使其成为一种重要的植物转基因工具，广泛应用于植物的遗传转化和瞬时表达实验中。然而，农杆菌很少直接用作重组克隆筛选的宿主菌。农杆菌侵染实验中所使用的重组克隆通常需要事先在大肠杆菌等其他微生物中筛选鉴定，这不仅使实验过程过于繁琐，更是增加了实验的耗时。

重组克隆筛选技术是现代分子生物科学研究的基础技术，在几十年的发展中得以快速完善。重组克隆构建筛选的常用策略有两类。第一类基于抗生素抗性基因的正筛选，这类基因可以使携带含有抗生素抗性基因质粒的微生物在含有相应的抗生素平板上生长，从而能够筛选到含有重组质粒的单菌落；第二类基于抑制微生物生长的基因的负筛选，这类基因通常预先连接到目标载体上，通过外源片段与之交换形成新的不含有生长抑制基因的重组克隆，从而在生长出的菌落里获得正确重组的克隆。第二类策略需要同第一类策略联用来实现重组克隆的构建筛选，这方面应用比较成功的为英潍捷基的gateway载体构建法(利用ccdb基因实现重组克隆的筛选)，这个方法也是应用较早的不必使用内切酶的载体高效构建方法。但是ccdb基因不能抑制农杆菌的生长，也不能用于在农杆菌中进行重组克隆的筛选。

大豆花叶病毒属于马铃薯Y病毒属病毒，基因组编码11个成熟蛋白(P1,HC-Pro,P3,P3N-PIPO,6K1,CI,6K2,NIa-VPg,NIa-Pro,NIb和CP)，因其能够侵染大豆并在叶片上形成花叶症状而得名。在中国，我们利用10个鉴别寄主将大豆花叶病毒不同分离物划分为SC1-SC21共21个株系。大豆花叶病毒整个生活史大部分阶段为在植物体内进行复制、装配和运输，其传播可以依赖同蚜虫体内受体蛋白的互作来实现。但是，至今没有关于马铃薯Y病毒属病毒与农杆菌互作的报道。

发明内容

本发明的目的是提供能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列。

本发明的另一目的是提供该序列在基因工程方面的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒基因，包含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明所述的大豆花叶病毒基因在抑制农杆菌生长中的应用。

所述的大豆花叶病毒基因优选自SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

我们构建了3个SMV的病毒克隆载体。将这3个病毒克隆载体转化到农杆菌EHA105菌株，转化两天之后，转有pCB301-SC3(#SC3)和pCB301-SC7(#SC7)的农杆菌可以正常生长，然而转有pCB301-SC15(#SC15)的农杆菌却未见生长(图1)。为了得到能够抑制农杆菌生长的最短序列，我们构建了一系列包含不完整SC15的克隆载体(图2)并转化农杆菌。我们发现能够抑制农杆菌生长的基因序列包含编码P1,HC-Pro,P3,P3N-PIPO,6K1,CI,6K2,NIa-VPg,NIa-Pro,NIb的序列，截短后会导致抑制能力的下降。

所述的大豆花叶病毒基因在基因工程中的应用。