[发明专利]一种制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的方法

说明书

本发明公开了一种制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的方法，属于甜味剂的生物合成技术领域。本发明用糖化酶催化水解高接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷，从而获得口感较好的以低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷为主的低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。产品中甜菊糖苷的单和二葡萄糖基取代物含量为总苷的60％以上，葡萄糖基接枝数小于等于3的葡萄糖基甜菊糖苷的质量百分数总计高于总苷的70％。本发明酶催化所得的单和二取代葡萄糖基甜菊糖苷在结构上与之类似，属于其同分异构体的混合物，甜度和矫味功能均较好。

技术领域

本发明涉及一种制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的方法，属于甜味剂的生物合成技术领域。

背景技术

甜菊糖苷是甜叶菊提取物中约40种糖苷分子的总称，均由具有甜味的亲水性糖基与疏水性的甜菊醇苷元组成。其中Rebaudioside D和Rebaudioside M的味质口感较好，莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，RA)口感较好但甜味略嫌持久，而斯替夫苷(Stevioside，St)、莱鲍迪苷C和其它低分子量甜菊糖苷则带有一定的轻微苦味或甘草余味，这种微苦余味降低了它作为天然甜味剂的品质。除了具有苦味的杂质对甜菊糖苷产品口感味质有影响外，甜菊糖苷自身的甜菊醇苷元分子结构也是产生苦涩余味和后甜(即甜味持久)的因素。而从味觉角度的生物学来看，不同甜菊糖苷与甜味受体和苦味受体的结合能差异是一个重要因素。

对甜菊糖苷口感进行改善的方法之一是利用酶法糖基化等方法引入糖基，利用接入糖基的空间位阻，改变甜菊糖苷与甜味受体和苦味受体的结合能差异，对其口感味质进行改善。但酶法糖基化会得到很多种无规的转糖基产物，典型的如各种葡萄糖基取代数或称接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷，产品中接枝数从1到20。葡萄糖基甜菊糖苷分子中，低接枝数产品如单和二葡萄糖基接枝的甜菊糖苷的质量百分数总计通常低于总苷的50％。所有葡萄糖基甜菊糖苷的甜度都会比原料甜菊糖苷的甜度有不同程度的降低，后味即口感也会有所改善。葡萄糖基取代数高的产品，可以用作矫味剂和餐桌糖，但甜度下降过多。葡萄糖基取代数低的产品，如甜菊糖苷的单和二葡萄糖基取代物，其甜度和矫味功能均较好；其结构同于天然甜菊糖中味质最好的RD和RM的同分异构体。

一种利用酶法糖基化等方法引入糖基对甜菊糖苷口感进行改善的方法，是采用来自嗜碱软性芽胞杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶催化甜菊苷St的转苷，得到9种产物，结构分析显示在C-13位和C-19位通过α-1,4糖苷键分别连接了1到3个葡萄糖基，而C-13位连接1个或2个葡萄糖基时，味质与St相比都已改善；当C-13位连接3个葡萄糖基时，甜度则大幅下降(Fukunaga,1989)。Lobov等利用普鲁兰酶(Pullulanase)和真菌淀粉酶(Biozyme L)，用于甜菊糖苷的转苷反应，分别得到三种产物；但反应所需时间较长且产物收率小于10％(Lobov,1991)。Abelyan用环糊精作为糖基供体，得到九种转糖基产物，其中两种葡萄糖基甜菊糖苷的甜味特性较好，但产率较低，产率之和为11.6％(Abelyan V A,2004)。Kochikyan用六种菌株生产出不同种类的环糊精葡萄糖基转移酶，以液化淀粉作为糖基供体催化甜菊糖苷转苷，得到七种转糖基产物(Kochikyan V T,2006)。

另一种对甜菊糖苷口感进行改善的方法，是用α-环糊精葡萄糖基转移酶Toruzyme3.0L和α-中温淀粉酶双酶法催化水解淀粉改性St，反应4h，St转化率达到77.11％，得到十四种甜菊糖苷衍生物；产物的后苦涩味明显改善，口感清甜。甜度最高的St-Glc1和St-Glc2的产率最高。以环糊精和斯替夫苷为底物，以10U/g斯替夫苷的加酶量，反应5h后斯替夫苷的转化率最高可达到87.8％(Li W,2013)。

美国专利US4219571和US7807206利用嗜热脂肪芽孢杆菌产的环糊精葡萄糖基转移酶，得到具有高达10的聚合度的α-1,4葡糖基衍生物。