[发明专利]一种MLD慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种MLD慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，其中，所述慢病毒载体还包括ARSA基因。本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入ARSA基因，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得ARSA基因在转基因的大脑相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成MLD基因治疗过程中正常基因的传递。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种MLD慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种应用改良后的慢病毒载体优化表达ARSA基因用于制备治疗异染性脑白质营养不良症的药物。

背景技术

异染性脑白质营养不良(Metachromatic Leukodystrophy,MLD)又称为ARSA缺失症(arylsulfatase A deficiency)，为染色体突变的遗传性疾病。发病原因是由于脑神经细胞中的酶arylsulfatase A(ARSA)缺失导致无法分解硫脂，使硫脂堆积在脑神经系统而损害神经细胞，尤其是少突胶质细胞和神经元细胞，并且CNS和PNS中会出现渐进性的脱髓鞘现象，其最为显著的是渐进性的神经性功能紊乱，早期会虚弱，张力减退和口齿不清，晚期症状包括了说话困难，精神功能退化，肌肉张力增加，普遍或部分性发作，视力、听力和外周神经病变下降，最后阶段会发生强直性痉挛，去大脑姿势和对周围失去感知。发病率约为四万分之一，而发病时间主要是根据硫脂在脑内堆积造成脑神经损害程度而定，因此MLD根据发病年龄分为三类：幼儿型、青少年型及成年型。通常来说，一个感染患者的每一个亲人都有25％的几率患此疾病，50％的几率为无症状的携带者，25％的几率是未患病或非携带者。

MLD是一种遗传性的常染色体隐性遗传疾病，其单基因突变造成了溶酶体堆积紊乱疾病(Lysosomal storage disease)，因此基因治疗方法理论上可以实现对该病的彻底治疗。在脑部直接注射携带正常ARSA基因的病毒载体可以直接对基因缺陷细胞进行脑内转染，从而修复细胞，分泌出所需要的芳基硫酸酯酶A，减少脑硫脂的堆积，并可以进过交叉校正(cross correction)方式修复周围细胞乃至整个脑部的细胞。

造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)与间质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)具有多项特征使其成为基因治疗中潜在的“运输工具”，HSCs以及MSCs可从血液或者骨髓中获得，并且具有分化成为一系列体细胞以及更新各种组织细胞的能力，所以通过体外修正的干细胞移植也是基因治疗的一种重要途径。

目前国内外应用病毒载体进行基因传递的基因治疗方法虽然有许多，但是不同病毒载体，甚至相同载体的不同制备方法引起的基因传递效率差异明显，而基因传递效率将直接影响疾病的治疗效果。

英国的葛兰素史克公司等机构也在尝试应用慢病毒载体携带正常ARSA基因针对20名患MLD病人进行基因治疗的临床试验，现在正在处于2期临床数据收集阶段，结果目前显示患者在几年内对治疗有一定的效果，根据初步数据的评估，安全性是可以得到一定保障，脑部ARSA酶的活性有较大的提升，在第二次的检测结果中，孩童的IQ超过了55，治疗效果较为显著，后续的临床数据还在持续追踪中。

现在大多应用细胞治疗对遗传病进行治疗的方法均存在效率过低以及仅针对血液干细胞进行修饰，使得疾病治疗的临床效果始终达不到预期，因此急需能够最大程度上提高病毒基因传递效率的方法来提高遗传疾病的疗效。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种MLD慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述MLD慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：