[发明专利]一种黏多糖贮积症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种黏多糖贮积症的慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，其中，所述慢病毒载体还包括MPS II基因。本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入MPS II基因，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得MPS II基因在转基因的大脑相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成黏多糖贮积症基因治疗过程中正常基因的传递。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种黏多糖贮积症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种应用改良后的慢病毒载体优化表达MPS II基因用于制备治疗戈谢病的药物。

背景技术

黏多糖贮积症II型也称汉特(Hunter)综合征，最早由Hunter(1917)描述。Mekusick(1965)将其分类为黏多糖贮积症Ⅱ型，属于伴性隐性遗传，由于艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduornate-2-sulphate sulphatase,IDS)基因突变所致。患病者均为男性，病人的母亲是携带者但不发病。此型又可分为两个亚型：MPSⅡ-A为重型，智力不全较重，多在15岁前死亡；MPSⅡ-B为轻型，智力正常，寿命较长，可存活到40岁以上。

由于病人体内缺乏艾杜糖-2-硫酸酯酶，而使酸性黏多糖降解发生障碍，该酶基因定位在Xq27.3～q28，由于酶的缺乏使过多的黏多糖沉积于组织细胞内，并随尿排出。随着组织细胞内黏多糖沉积的增多，导致功能障碍。呼吸有鼾音，常伴有慢性呼吸道感染。肺动脉高压和冠状动脉梗死也很多见。常有心脏扩大并伴有收缩期和舒张期杂音。重型者智力不全较明显。

初生时多正常，约从2岁开始即出现发育落后、骨骼及面容呈轻度胡勒综合征，但较轻，发生较晚，进展也较慢。可有关节强直、爪状手、短小，但无脊柱后弯。第2和5指骨中节短小，掌骨近端不变尖。桡骨、尺骨远端关节面可相对倾斜而成角，腕关节间隙轻度狭窄。成人常有继发性骨关节改变。皮肤呈皱褶性或结节性增厚，尤以上肢及胸部明显，有时可呈对称性分布，并有多毛。可因视网膜变性而失明。常有进行性耳聋。肝脾肿大，伴有慢性腹泻。尿中出现过多的硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素。

诊断依据尿中排出硫酸皮肤素与硫酸类肝素之比为1:1。成纤维细胞培养，35S粘多糖积蓄，加入纯化的Hunter综合征因子可得到纠正，此可间接证明为艾杜糖-2-硫酸酯酶活性缺乏。如能直接测血清和细胞内酶活性则可确诊。

黏多糖贮积症是单基因突变造成的艾杜糖-2-硫酸酯酶活性丧失的疾病，因此基因治疗方法理论上可以实现对该病的彻底治疗。脑内注射intraventricular injection将药物直接注入脑室内。实验时将微量药物注射管人侧脑室。该方法操作简便，费用较低，可用于观察不同药物注人脑室后各种生理指标和变化。

目前国内外应用病毒载体进行基因传递的基因治疗方法虽然有许多，但是不同病毒载体，甚至相同载体的不同制备方法引起的基因传递效率差异明显，而基因传递效率将直接影响疾病的治疗效果。现在大多应用基因治疗对遗传病进行治疗的方法均存在效率过低以及仅针对血液干细胞进行修饰，使得疾病治疗的临床效果始终达不到预期，因此急需能够最大程度上提高病毒基因传递效率的方法来提高遗传疾病的疗效。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种黏多糖贮积症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述黏多糖贮积症慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：

(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；

(b)其仍具有病毒包装信号功能；