[发明专利]一种催化制备UDP-鼠李糖的融合酶及其应用

说明书

一种催化制备UDP‑鼠李糖的融合酶及其应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明获得了一种能实现辅酶自循环而催化UDP‑葡萄糖生成UDP‑鼠李糖的融合酶VvRHM‑NRS，在反应体系中只需在起始阶段添加少量的NAD⁺，无需加入NADPH，就可生成UDP‑鼠李糖，这是首次能实现辅酶自循环而合成UDP‑鼠李糖。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种融合酶的构建及其在催化制备UDP-鼠李糖中的应用。

背景技术

L-鼠李糖是一种6-脱氧几糖，广泛存在于糖蛋白、多糖及次级代谢产物中，并发挥重要的生理活性。糖基化合物的生物合成主要是由各种不同糖基转移酶参与催化。这些酶选择性地转移特异性核苷二磷酸糖的单糖残基合成各种糖基化产物。但真核生物糖基转移酶催化底物仅限于有限几种核苷二磷酸糖，其中尿苷二磷酸糖基就是最重要的生物合成糖甙、寡糖、多糖和糖蛋白等含糖基化合物的糖基供体之一。

UDP-鼠李糖在结构上是由一分子鼠李糖和一分子尿苷二磷酸所组成，是构建鼠李糖基衍生物的重要中间体，因此如何高效合成UDP-鼠李糖一直受到研究人员的关注。利用化学合成法获得UDP-鼠李糖存在得率低、反应专一性差、副产物多等缺点，而生物酶法能很好弥补化学合成的不足。

在植物体内，UDP-鼠李糖合成酶(UDP-rhamnose synthase)通过连续的三步反应催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖。第一步反应是UDP-葡萄糖生成UDP-4-keto-6-deoxy-glucose，同时消耗NAD⁺生成NADH；第二步反应是UDP-4-keto-6-deoxy-glucose生成UDP-keto-rhamnose；第三步反应是UDP-keto-rhamnose被催化生成UDP-鼠李糖，同时消耗NADPH生成NADP⁺。由此可见虽然可以在体外利用UDP-鼠李糖合成酶催化UDP-葡萄糖合成UDP-鼠李糖，但必须在反应体系中添加至少与产物量相等的两种辅酶NAD⁺和NADPH，而NADPH辅酶的价格昂贵，因此该催化体系成本过高(专利申请号：CN201710230581.1；The Journal ofBiological Chmeistry 2007,282(8),5389-5403)。另一种方法是在体外催化系统中分别构建NAD⁺/NADH及NADP⁺/NADPH的循环体系，但另外构建两个辅酶的循环体系所需要的酶种类繁多，使得反应体系不具有可行性。因此，比较可行的方法是获得一种UDP-鼠李糖合成酶，该酶可实现辅酶自循环，即第三步反应能利用NADH为辅酶生成NAD⁺，这样就可与第一步反应组成辅酶自循环系统，彻底解决UDP-鼠李糖合成过程中的辅酶供应问题。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种催化制备UDP-鼠李糖的融合酶及其应用，利用蔗糖、UDP及NAD⁺制备UDP-鼠李糖。

技术方案：一种催化制备UDP-鼠李糖的融合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

编码所述融合酶的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

含有所述核苷酸序列的重组质粒。

含有所述重组质粒的大肠杆菌。

所述的融合酶与蔗糖合成酶组成双酶催化体系在制备UDP-鼠李糖中的应用。

上述应用的反应体系为50mM pH 8.0的磷酸缓冲液，300mM蔗糖，8mM UDP，1mM NAD⁺，1mM DTT和0.16mg/mL融合酶及0.02mg/mL蔗糖合成酶，30℃反应48小时，能获得0.57mM的UDP-鼠李糖。