[发明专利]一种循环数可连续调节的快速数字PCR芯片

说明书

一种循环数可连续调节的快速数字PCR芯片，包括相互嵌套的高温部件、低温部件和荧光检测部件，3个部件均由厚度相同的上片和下片玻璃贴合形成；高温部件下片玻璃上表面刻蚀有多个第一U型流道以及蛇形流道、储油池、进样池、多个第一限位标识和“十”字形流道，“十”字形流道中的一条流道与进样池连通，两条流道与储油池连通，第四条流道与蛇形流道连通；在高温部件下片玻璃的下表面贴合有加热片；低温部件下片玻璃上表面刻蚀有多个第二U型流道和一个第二限位标识，在低温部件下片玻璃的下表面贴合有加热片；荧光检测部件下片玻璃上表面刻蚀有液滴存储腔、排油池与流道；本发明实现PCR的循环数的连续调节，可对生物样本进行快速、精确的定量检测。

技术领域

本发明涉及微流控生物芯片技术领域，具体涉及一种循环数可连续调节的快速数字PCR芯片。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)被看做分子生物学领域中核酸体外扩增和定量检测的一项核心技术，PCR早期的检测技术主要有凝胶电泳和荧光定量PCR检测技术，直到Vogeldteion和Kinzler提出了一种新的核酸定量技术—数字PCR(Digital PCR，dPCR)。数字PCR的原理是将PCR反应溶液分散成成千上万个微小反应单元，每个反应单元均含有进行PCR扩增的必要成分，因此这些反应单元便可以看成微小的PCR反应体系，然后在温度循环中进行PCR扩增。扩增结束后，含有待检测目标分子的反应单元发出荧光，记为阳性信号，不含有待检测目标分子的反应单元没有荧光，记为阴性信号。统计阳性信号和阴性信号的数量，通过泊松分布计算便可以得到待检测目标分子精确的拷贝数，从而实现目标分子的绝对定量检测。

凝胶电泳和实时荧光定量PCR技术是核酸检测的常用方法。但是，凝胶电泳检测存在灵敏度低、操作繁琐、仅能定性分析等缺点。实时荧光定量PCR在定量目标分子时，需要根据Ct值绘制标准曲线，由于Ct值的细微变化会造成检测精确度降低，且只能对目标分子进行半定量分析。数字PCR不仅克服了凝胶电泳检测的不足，而且通过直接统计每个反应单元的阴阳性信号的数目来代表目标分子的拷贝数，无需标准曲线就可对目标分子精确检测，实现了目标分子的绝对定量分析。同时，数字PCR将大体积的均相反应液细分成数万个微小反应单元，对于低丰度样本检测，每个微小反应单元相当于对低丰度样本进行富集，大大提高了检测的灵敏度。

基于连续流体的数字PCR芯片技术通过在芯片中设置高温部件和低温部件，使流道中的PCR反应单元在不同的温度部件中循环流动，从而实现了变性—复性—延伸的热循环过程。整个过程不再依赖精确的控温装置对升降温进行控制，为快速PCR提供了条件。然而，现有的基于连续流体的PCR芯片技术忽略了PCR循环数是PCR过程中的重要参数。Li等[Anal.Chem.,2016,88,11384-11389]利用液滴式数字PCR对核酸精确定量检测的研究中指出：PCR循环数直接影响核酸检测的灵敏度和准确性，低循环数导致扩增不充分使检测灵敏度降低，高循环数因产生大量非特异性扩增进而影响检测准确性，因此优化PCR循环数是十分必要的。尤其对于基于面阵式终点荧光检测的数字PCR而言，控制PCR循环数能够有效提高检测的信噪比，减少阴阳性信号之间“雨滴”的产生，提高检测的灵敏度和准确性。在检测低丰度样本时，适当增加PCR循环数有利于阳性信号从大量阴性信号中检测出来，从而提高了检测的灵敏度；对于高丰度样本，适当降低PCR循环数可以使阴性信号不被大量阳性信号所湮没，从而提高检测的准确性。

Christopoulos等[Analytica ChimicaActa,2003,494,1–9]为解决基于连续流体的PCR芯片无法优化PCR循环数的不足，提出了PCR循环数可调节的PCR芯片，但芯片设计仅能选择四种固定的PCR循环数，且循环数的跨度较大，无法实现PCR循环数的连续调节，不利于基于连续流体的数字PCR实验设计和基于面阵式的荧光检测。因此，发明一种PCR循环数可以调节的数字PCR芯片进行核酸的快速检测是十分必要的。

发明内容