[发明专利]一种雌二醇酶结合物的制备方法

权利要求书

1.一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述雌二醇酶结合物是由雌二醇衍生物（E2-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。

2.根据权利要求1所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述雌二醇衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和雌二醇的化学合成物质，化学结构式为：

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3.根据权利要求1所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述雌二醇衍生物为或N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和雌二醇的化学合成物质，化学结构式为：

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4.根据权利要求1或2所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于，所述雌二醇衍生物的合成方法如下：

S1、雌二醇二醋酸酯的制备：取雌二醇加入到无水吡啶、乙酸酐中，在油浴中回流2小时，冷却至室温后，冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶的雌二醇二醋酸酯；

S2、雌二醇二醋酸酯-6-酮的制备：取步骤S1得到的雌二醇二醋酸酯于冰醋酸中，加入CrO₃，于37℃水浴反应4小时，加入蒸馏水，用乙醚萃取，醚相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至红色出现后，用蒸馏水洗涤至中性，加入硫酸镁干燥，得到黄色油状物，用乙酸乙酯：正已烷（1:4）溶解黄色油状物后,过色谱柱收集雌二醇二醋酸酯-6-酮的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的雌二醇二醋酸酯-6-酮；

S3、6-酮-雌二醇的制备：取雌二醇二醋酸酯-6-酮溶解于氢氧化钠-甲醇溶液中，室温静置，加入蒸馏水，用稀盐酸调节PH至3.0左右,用无水乙醇重结晶得6-酮-雌二醇；

S4、雌二醇-6-肟的制备：取6-酮-雌二醇溶解于甲醇溶液中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐和醋酸钠溶液，37℃水浴反应8小时，冰浴降温4小时，析出针状结晶过滤，滤液用氢氧化钠溶液调整PH至8.5左右，用乙酸乙酯萃取；剩余滤液盐酸溶液调整PH至3.0左右用乙酸乙酯萃取；合并乙酸乙酯并减压蒸干，用丙酮-正已烷重结晶，得到雌二醇-6-肟；

S5、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与雌二醇合成物的制备：取雌二醇-6-肟溶解于2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，避光条件下2～8℃反应12h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺与雌二醇合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺与雌二醇合成物。

5.根据权利要求1所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的一种，优选为碱性磷酸酶。

6.根据权利要求1所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：将雌二醇衍生物与酶加入到缓冲液中，然后避光反应，再除去未反应完全的雌二醇衍生物，即得到雌二醇酶结合物。

7.根据权利要求6所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：将雌二醇衍生物与酶按一定比例加入到缓冲液中，所述雌二醇衍生物与酶的质量比为1:5～1:200，优选为1:20～1:150，最优选为1:50～1:100。

8.根据权利要求6所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的一种或多种，优选为碳酸盐缓冲液；所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。

9.根据权利要求6所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述避光反应温度为4℃～37℃，反应时间为0.5～24小时。

10.根据权利要求6所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述除去未反应完全的雌二醇衍生物的方法有超滤法、透析法、脱盐柱法，加入保护剂，得到睾酮酶结合物，所述保护剂优选为甘油。