[发明专利]半滑舌鳎IGF-I蛋白及其体外表达制备方法与应用

权利要求书

1.一种半滑舌鳎IGF-I蛋白，其特征在于所述半滑舌鳎IGF-I蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO:2。

2.权利要求1所述的一种半滑舌鳎IGF-I蛋白，其特征在于所述半滑舌鳎IGF-I蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:3。

3.权利要求1所述半滑舌鳎IGF-I蛋白的体外表达制备方法，其特征在于它包括成熟肽序列改造、重组表达载体构建、重组表达载体诱导表达和重组蛋白纯化；

所述的成熟肽序列改造，对半滑舌鳎IGF-I成熟肽的核苷酸序列SEQ IDNO:1根据酵母菌的密码子偏好性进行改造，获得适宜在酵母菌内高效表达的核苷酸序列SEQ IDNO:2；

所述的重组表达载体构建，在目的核苷酸序列SEQ IDNO:2上添加酶切位点和His×6标签后与真核表达载体pPICZaA进行重组，构成可表达氨基酸序列为SEQ IDNO:3的半滑舌鳎类胰岛素生长因子I多肽的重组表达载体pPICZaA-IGF-I；

所述的重组表达载体诱导表达，将重组表达载体线性化，电转导入处于化学感受态的表达菌株Pichia pastoris X33，形成重组表达菌株pPICZaA-IGF-I-Pichia pastorisX33，挑选高效表达的阳性克隆进行培养，并利用甲醇诱导重组表达菌分泌表达目的蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的重组表达载体构建步骤中所述添加酶切位点是指在目的核苷酸序列上游添加XhoI酶切位点，在下游添加XbaI酶切位点，并在目的核苷酸序列上游引入毕赤酵母蛋白酶Ste13酶切位点。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的重组表达载体构建步骤中添加His×6标签是指添加于目的核苷酸序列下游。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的重组表达载体诱导表达具体方法为取线性化的重组表达载体pPICZaA-IGF-I加入处于化学感受态的表达菌株Pichiapastoris X33，置于电转杯内，冰上放置6分钟后，利用电转仪转化，同时加入山梨醇，将电转后的液体转入离心管中30℃静止1.5h，然后转入YPD培养基中培育2h，培育条件：30℃，200rpm摇动，然后，涂布YPD平板，培养；

挑选平板培养的阳性克隆，以BMGY培养基培养，30℃200rpm，然后收集菌体利用BMMY培养至OD值至1.0时，加入甲醇诱导重组表达菌株分泌表达目的蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述甲醇诱导浓度为0.5％。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述诱导的条件为：温度为30℃，pH为5.0，诱导时间为36h。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的重组蛋白纯化，是指将培养的半滑舌鳎IGF-I重组表达酵母菌上清液以硫酸铵沉淀后再溶解，上清液经过微滤膜过滤后经过滤柱挂柱，再以洗脱液洗脱后即可得到纯化的目的蛋白。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述的硫酸铵浓度为350mg/L、微滤膜孔径为0.45μm。