[发明专利]一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法

权利要求书

1.一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于，在含有纤维素原料的酶解体系中，加入里氏木霉纤维素酶，草菇纤维二糖脱氢酶、黑曲霉葡萄糖氧化酶，进行协同酶解反应，一锅法制备出葡萄糖酸。

2.根据权利要求1所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述的纤维素原料包括滤纸和碱法预处理后的植物秸秆。

3.根据权利要求1所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述的里氏木霉纤维素酶为里氏木霉D-86271纤维素酶。

4.根据权利要求1所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于：在所述的酶解体系中加入Ampicillin和Zeocin。

5.根据权利要求1所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于：在45℃，180rpm通风条件下恒温摇床进行酶解反应48h以上。

6.根据权利要求1所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于：在所述的酶解体系中添加4％液体石蜡。

7.根据权利要求1-6任一项所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)里氏木霉纤维素酶制备：将保藏的Trichoderma reesei D-86271菌株接种到PDA培养基上，28℃培养5-7d，待长出一层菌丝体后，储存于4℃冰箱中备用；用接种环挑取少量Trichoderma reesei D-86271菌丝体接入50mL液态发酵培养基中，于28℃，180rpm恒温摇床培养3d；在固态发酵培养基中加入1mL Trichoderma reesei D-86271发酵液体培养液，混匀，静置于恒温控湿培养箱，30℃，湿度70％，发酵7d；离心收集酶液；

2)草菇纤维二糖脱氢酶制备：含VvCDH基因的工程菌接入4mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜后，取200μL菌液到50mL BMGY培养基中，30℃，200rpm条件下培养过夜至OD₆₀₀达到2.0左右，4200rpm离心5min收集菌体，弃上清，菌体用25mL BMMY培养基重新悬浮，于28℃，200rpm条件下诱导产酶，每24h向培养基中加入终浓度为1％的过滤除菌后的甲醇；诱导7d后，5400rpm，离心10min，收集酶液。

3)一锅法酶水解-氧化纤维素产生还原糖和葡萄糖酸：酶解的反应体积为2.5mL，其中含有35mg 1×3.5cm Whatman 1号滤纸或0.05g碱预处理麦秆，0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶，以及VvCDH或/和GOD，在100mM，pH 4.8的柠檬酸钠缓冲液中进行酶解，体系中加入终浓度为100μg/mL的Ampicillin和Zeocin；体系中加入4％液体石蜡；在45℃，180rpm通风条件下恒温摇床进行酶解反应48h后，将所有样品在99℃煮沸5min灭活，10000rpm离心10min，取上清进行后续分析测定。