[发明专利]一种用于十字花科作物花粉快速染色的染色液及方法

说明书

本发明公开了一种十字花科作物花粉的快速荧光染色方法，包括如下步骤：S1染色液配制：首先将Hoechst33258荧光染料和蔗糖溶于磷酸盐缓冲液PBS，配成Hoechst33258浓度20‑40μg/L、蔗糖浓度8‑10wt％的溶液一，然后配制含乙醇60‑70％(v/v)、乙酯乙酸10％(v/v)、甘油30‑20％(v/v)的溶液二，将溶液一和溶液二按体积比1:1混合摇匀得到染色液，并低温避光保存；S2染色：取步骤S1中制得的染色液于载玻片上，然后从花序上摘取需要染色观察的开放花朵或花蕾，用镊子摘取花药直接放入载玻片上的染色液中，轻轻捏挤花药，散出花粉，取出杂物，涂抹使花粉与染色液混合均匀，然后盖上盖玻片。本发明可以解决目前花粉荧光染色法所存在的繁琐、费时及耗工的问题，同时提高荧光染色法的稳定性和重现性。

技术领域

本发明涉及一种花粉荧光染色方法，具体涉及一种用于十字花科作物花粉快速染色的染色液及方法。

背景技术

植物花粉壁是一层主要由孢粉素和纤维素组成的特殊细胞壁，由外壁和内壁两层组成。其中，外壁又分为内外两层，外壁外层呈蜂窝状或网状，外壁内层则为平坦结构，外壁的主要成分是孢粉素类物质。而内壁结构相对简单，主要含有纤维素、果胶和蛋白质等。由于植物花粉壁在结构上比一般的植物细胞壁复杂，且紧密厚实，尤其是成熟花粉粒，其通透性及光透性极差，因此多数植物花粉染色后不结合透明技术在显微镜下难于观察到清晰细胞核。

目前，植物花粉染色常用的方法有醋酸洋红染色法、苯酚品红法、铁矾苏木精染色法及荧光染色法等，一般采用“固定(卡诺氏固定液)→洗涤→染色→脱色→镜检”的操作步骤，但对于绝大多数的植物成熟花粉，还需要经过乙醇分级脱水和冬青油透明后才能观察，其操作步骤繁琐、耗时，完成整个操作过程需要数个小时以上，甚至长达2-3天。

从染色剂的特异性看，醋酸洋红染色法、苯酚品红法和铁矾苏木精染色法所使用的染色剂与荧光染色所使用的荧光染料(如Hoechst33258、DAPI等)相比，其特异性相对较差，对质核均可染色，只是染色程度有所不同，因此染色时间及脱色对染色结果影响极大，另外其染色效果还因作物种类、花粉发育时期以及染色时的温度条件等的不同有很大差异，因此这些方法在实际操作中往往会因染色时间过长过短或者脱色不当而得不到清晰、且质核染色反差鲜明的结果。荧光染色法使用的是与DNA特异结合的荧光染料，其与DNA链结合速度极快，十几分钟内即可达到饱和，不会出现因染色时间过长而导致细胞质染色过深影响结果观察的问题，而且染色结果稳定，因此荧光染色法在具备有荧光显微镜的试验条件下已成为植物花粉染色观察的首选方法。

近年，十字花科作物游离花粉(小孢子)培养在育种中得到了广泛应用，在进行花粉培养时需要对其花粉发育时期进行准确断定，由于荧光染色剂对DNA的特异性和稳定性，利用荧光剂染色观察确定花粉发育时期的研究者趋于增加，但是均采用上述繁琐、耗时的操作步骤，难于做到短时间内完成花粉发育时期的判定，而且成熟花粉粒采用常规的冬青油透明技术会使花粉壁轮廓与背景的分界变得不清，营养核的荧光染色强度也会因脱水步骤而有所降低，从而使荧光染色法的效果大打折扣。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于十字花科作物花粉快速染色的染色液及方法，解决目前花粉荧光染色法所存在的繁琐、费时及耗工的问题，同时提高荧光染色法的稳定性和重现性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于十字花科作物花粉快速染色的染色液，包括如下步骤：

S1染色液配制：首先将Hoechst33258荧光染料和蔗糖溶于磷酸盐缓冲液PBS，配成Hoechst33258浓度20-40μg/L、蔗糖浓度8-10wt％的溶液一，然后配制含乙醇60-70％(v/v)、乙酯乙酸10％(v/v)、甘油30-20％(v/v)的溶液二，将溶液一和溶液二按体积比1:1混合摇匀得到染色液，并低温避光保存；