[发明专利]复合冻存液及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种复合冻存液及其制备方法和应用，主要由以下组分组成：聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、甘油、Rock抑制剂和溶剂。本发明利用聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、甘油和Rock抑制剂等作为主要成分组成复合冻存液，无需添加二甲亚砜，排除了DMSO细胞毒性的风险，可用于脂肪干细胞胶在超低温中进行长期甚至永久的保存，为未来的脂肪移植提供有活性的、安全的、有效的自体填充物。使用本发明的复合冻存液冻存的脂肪干细胞胶在冻存6个月后，移植于动物体内，3个月后仍呈现良好的保留率与组织形态，且未见并发症或不良反应出现。

技术领域

本发明涉及细胞冻存领域，特别是涉及一种复合冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

脂肪干细胞胶(SVF-gel，Stromal Vascular Fraction-gel)是纯物理方式处理的人脂肪组织的去油后浓缩产品，富含脂肪来源干细胞与其他功能性基质血管成分(SVF)细胞，因其质地细腻如胶体，可通过细针注射，命名为脂肪干细胞胶。脂肪干细胞胶可作为类似干细胞富集物的组织填充剂，拥有巨大的临床治疗潜力。由于去除了脂肪的脂质成分，SVF-gel的移植存活率较传统脂肪提高30％-50％左右。另外，由于其多倍数的浓缩了脂肪来源干细胞，在软组织修复领域(创面、瘢痕、缺血性软组织活化、脂肪萎缩等)展示了良好的应用前景。若利用SVF-gel发挥类似干细胞疗法的效应，就可能需要周期性、多个疗程的SVF-gel注射。而多次填充/治疗就伴随着多次吸脂手术，不仅提高了成本，更给患者带来反复手术的不适、风险与恢复期的时间代价。此外，脂肪组织内主要的再生关键成分，脂肪干细胞(Adipose-derived Stem Cell，ASC)，会随着患者年龄增长而功能下降，保存患者年轻时的高功能ASC，对于未来的修复与美容也有着巨大的意义。因此，对于医患来说，改进长期冷冻技术的必要性不言而喻。但是，一般的冻存液的性能较差，无法满足脂肪干细胞胶的临床需求。

发明内容

基于此，有必要提供一种冻存性能优异的复合冻存液。

一种复合冻存液，其有效成分主要由以下组分组成：聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、甘油和Rock抑制剂。

本发明利用聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、甘油和Rock抑制剂等作为主要成分组成复合冻存液，无需添加二甲亚砜(DMSO)，排除了DMSO细胞毒性的风险，可用于脂肪干细胞胶在超低温中进行长期甚至永久的保存，为未来的脂肪移植提供有活性的、安全的、有效的自体填充物。聚乙烯吡咯烷酮有别于非渗透性冷冻保护剂和如二甲亚砜等渗透性冷冻保护剂，其毒性极小，属于国家食品药品监督管理局批准应用于人体的医药级成分，能优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少细胞内外冰晶的形成，同时因其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤，在长时间冻存后仍能帮助维持细胞活性。海藻糖由于具有较大的水合半径，因此可以更好地发挥脱水后保持细胞膜完整性的作用，促进离子穿过膜的传输，降低膜脂的融点，使蛋白质的稳定性最大化。Rock(Rho-associated protein kinase，Rho蛋白相关激酶)抑制剂的加入可有效增强冷冻保存后脂肪干细胞群抗凋亡能力的恢复，以针对性地提高对脂肪干细胞胶的冻存效果；甘油的毒性很低，可作为辅助冷冻保护剂进一步提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害。使用本发明的复合冻存液冻存的脂肪干细胞胶在冻存6个月后，移植于动物体内，3个月后仍呈现良好的体积保留率与组织形态，且未见并发症出现。

在其中一个实施例中，所述Rock抑制剂为盐酸法舒地尔。

在其中一个实施例中，所述复合冻存液中，所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为2～3mmol/L，所述海藻糖的浓度为0.2～0.3mol/L，所述甘油的浓度为1.8～2.2mol/L，所述Rock抑制剂的浓度为8～12μmol/L。

在其中一个实施例中，所述复合冻存液的溶剂为Hank’s平衡盐溶液。

在其中一个实施例中，所述复合冻存液中还包含谷氨酰胺。