[发明专利]一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法

权利要求书

1.一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：首先收集收集鲢鳙鳍条样本，并采用传统酚-氯仿的方法提取基因组DNA，随后根据目的扩增片段长度差异的要求涉及引物对，选取扩增条带清晰的3组4重PCR体系，共涉及12个微卫星标记，最后对引物进行荧光修饰及扩增验证。

2.权利要求1所述鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是所述3组4重PCR体系具体如下：

体系1：包括4个微卫星位点，分别为Arsd684、Hysd61-5、Hysd9-2和Arsd549；体系2：包括4个微卫星位点，分别为Arsd380、Arsd443、Hysd3112-1和Arsd639；体系3：包括4个微卫星位点，分别为Hym435、Arsd86、Arsd291和Arsd99。

3.权利要求1所述鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是所述3组4重PCR体系中采用的引物对核苷酸序列具体如下：

体系1：

Arsd684位点正向引物如SEQ ID NO.1所示，Arsd684位点反向引物如SEQ ID NO.2所示；

Hysd61-5位点正向引物如SEQ ID NO.3所示，Hysd61-5位点反向引物如SEQ ID NO.4所示；

Hysd9-2位点正向引物如SEQ ID NO.5所示，Hysd9-2位点反向引物如SEQ ID NO.6所示；

Arsd549位点正向引物如SEQ ID NO.7所示，Arsd549位点反向引物如SEQ ID NO.8所示；

体系2：

Arsd380位点正向引物如SEQ ID NO.9所示，Arsd380位点反向引物如SEQ ID NO.10所示；

Arsd443位点正向引物如SEQ ID NO.11所示，Arsd549位点反向引物如SEQ ID NO.12所示；

Hysd3112-1位点正向引物如SEQ ID NO.13所示，Hysd3112-1位点反向引物如SEQ IDNO.14所示；

Arsd639位点正向引物如SEQ ID NO.15所示，Arsd639位点反向引物如SEQ ID NO.16所示；

体系3：

Hym435位点正向引物如SEQ ID NO.17所示，Hym435位点反向引物如SEQ ID NO.18所示；

Arsd86位点正向引物如SEQ ID NO.19所示，Arsd86位点反向引物如SEQ ID NO.20所示；

Arsd291位点正向引物如SEQ ID NO.21所示，Arsd291位点反向引物如SEQ ID NO.22所示；

Arsd99位点正向引物如SEQ ID NO.23所示，Arsd99位点反向引物如SEQ ID NO.24所示。

4.如权利要求1所述鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是具体步骤如下：

（1）鲢鳙样本采集及DNA的制备：分别收集鲢鳙鳍条样本，保存于无水乙醇中；采用酚-氯仿的方法提取基因组DNA，通过浓度为1.0%~1.5%琼脂糖凝胶电泳检测质量和纯度，利用紫外分光光度仪测量核酸浓度，最终稀释至20~50ng/μL，并保存于0~4℃备用；长期保持需冻存于-18~-20℃；

（2）荧光修饰及PCR扩增：在权利要求3所述引物对中的正向引物5'端进行FAM或HEX荧光基团修饰，并以步骤（1）获得DNA为模板，按照权利要求2所述3组4重PCR体系进行PCR扩增，扩增产物经浓度为2.0%~2.5%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，进行等位基因分型。

5.如权利要求4所述鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：所述PCR扩增时，为避免相邻位点的扩增条带出现重叠，目的扩增片段长度分为100~180bp、180~260bp、260~340bp和340~420bp的4个不同区间长度。