[发明专利]一种提高富士苹果花芽孕育率的药剂及测定方法

说明书

本发明属于园艺；蔬菜的栽培技术领域，公开了一种提高富士苹果花芽孕育率的药剂及测定方法，所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂为葡萄糖。本发明通过外源葡萄糖喷施处理富士苹果‘长富2号’品种，研究其对花芽孕育的影响，基于RNA‑seq测序手段，全面解析外源葡萄糖调控苹果花芽孕育过程中糖代谢以及成花相关基因表达模式；利用重测序技术鉴定比较不同成花特性芽变品种成花相关基因DNA多态性变异差异，发掘差异基因。葡萄糖处理促使短枝顶芽中可溶性糖及淀粉含量的上升，有利于短枝顶芽在花芽生理分化期的生长，富士成花率显著提升。

技术领域

本发明属于园艺；蔬菜的栽培技术领域，尤其涉及一种提高富士苹果花芽孕育率的药剂及测定方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：据FAO(2016)统计数据显示，全球苹果栽培面积达到529.33万公顷，总产量8932.92万吨，单产168758百克/公顷。苹果作为栽培作物由来已久，在漫长发展过程中种类逐增，是全球最重要的农业经济作物之一。同时，苹果作为我国第一大商品性水果品种，FAO(2016)统计数据显示我国苹果栽培面积238.39万公顷，产量4444.86万吨。有数据统计以来，从1993年开始，我国的苹果在栽培面积和产量上就已经位居世界的首位。‘富士’苹果，起源于日本农林水产省，1939年本省果树试验场以国光为母本，元帅为父本进行杂交，经过数十年的品种选育，专家发现芽变品种在生产中利用愈加广泛。红富士是从普通富士的芽(枝)变中选育出的着色系富士的统称。‘长富1号’是第一个富士片红芽变品种。至今，大概有100个芽变品种被运用到栽培中，根据表型的变化大致将其分为三类：着色型芽变，短枝型芽变和早熟型芽变(束怀瑞1999)。‘富士’在我国种植面积占比达到70％，产量占比达到65％，是我国最主要的栽培品种。但是在实际栽培中，还存在诸多问题，比如普通富士难成花、童期较长、大小年现象严重，使其产量及其不稳定。在实际生产中，现多采用修剪，拉枝，环割等手段缓解这一现象。虽然一定程度上缓解了‘富士’苹果的产业难题，但技术繁琐、成本巨大、难于统一化的劣势也显而易见。研究富士苹果花芽分化的生理与分子机制，寻求解决富士苹果难成花的技术是急待解决的产业问题。众所周知，植物开花的时间是内外因素共同调控，外在环境因素有光照时间、光质、水分、营养物质等，内在因素有发育阶段、营养状态、激素水平等。苹果等果树花芽分化主要包括两个重要时期：生理分化期与形态分化期。苹果等多年生木本植物，在经过一定阶段营养生长之后，树体进入生殖生长发育阶段。此过程中，完成营养物质的积累后的茎尖分生组织在一定的条件诱导下，属性逐渐改变，成为花序分生组织，而这个过程被称为芽生理分化期。这一时期是花芽诱导和花芽发端的关键时期，其包括成花诱导(Floral Induction)和成花起始(Floral Initiation)两个阶段。成花诱导指在成花基因诱导下，茎尖分生组织内部结构改变，其生长状态由营养生长逐渐过渡至生殖生长，并有花芽分化的趋势。花芽发端指完成花芽孕育的过程，此时的茎尖分生组织逐渐分化，不可逆转的形成花器官原基。研究发现，苹果当年生枝条的停长的时期就是花芽孕育的起始点，一般在花后40-50d左右。之后进入花芽的形态分化期，其特点为分生组织呈扁平状，顶芽生长点增大变圆，芽的形态结构发生由花原基发育为成熟的花器官，常见于盛花期后100d左右。花芽分化这一复杂但重要的过程，直接影响到苹果开花的数量、质量以及坐果率等。由于关系到产业现实问题，所以苹果花芽分化的生理与分子机制长久以来都是果树科学研究的重点。为了揭示植物成花转变的机制，在模式植株拟南芥中，科学家进行了大量的报道与研究。在现有报道中，众多调控植物开花的相关基因在拟南芥中已被鉴定出来，并且明确6条植物开花信号调控途径：即光周期途径(photoperiod pathway)、自主途径(autonomous pathway)、春化途径(vemalizationpathway)、赤霉素途径(gibberellin pathway)、温敏途径(ambient temperaturepathway)、年龄途径(aging pathway)，这几个途径组成一个复杂的基因网络共同调控植物开花时间。光周期对植物形态建成具有重要作用，也是调节成花诱导的关键外源因子。植物通过对外界昼夜相对长短的变化来调控成花。拟南芥是长日照植物，长日照下促花，短日照下开花受到抑制，其光感受部位部位为叶片。光周期诱导下，光受体(光敏素，隐花素和紫外线B类受体)在昼夜节律(circadian rhythm)发生改变时，植物体内光周期平衡被打破，会直接影响一些基因的表达，从而调控开花过程。CONSTANS(CO)是光周期途径下游的关键基因，在整个通路中具有桥梁作用。一方面它受到上游的昼夜节律基因的调控，GIGANTEA(GI)可通过F-box泛素连接酶家族之间的相互作用来促进一些CO转录抑制因子的降解，例如FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-BOX1(FKF1)蛋白可以降解CYCLING DOF FACTOR(CDF)，从而正向调控CO表达(Ayre et al.2004)。此外，在缺少光照的条件下，CONSTITUTIVEPHOTOMORPHOGENIC1(COP1)泛素连接酶可以降解CO调控其表达。另一方面，CO能直接正向调控下游开花时间调节基因SUPPRESSOR OF OVEREX-PRESSION OF CONSTANS1(SOC1)、FLOWERING LOCUST(FT)和LEAFY(LFY)的表达。在苹果中已克隆出光周期相关的同源基因：PHYTOCHROME、CO、FT等。苹果中存在CONSTANS-like(COL)与NUCLEAR FACTOR Y(NF-Y)的互作，且二者共同调控FT1的表达。春化作用是指在低温诱导(4℃)条件下，且低温持续一定时长(7-56d)，植物表现出开花表型的过程。该途径中发挥主要作用的基因是MADS-box成花抑制因子FLOWERINGLOCUS C(FLC)。春化过程中，低温促使FLC反义转录产生反义长链非编码RNA COOLAIR，引发FLC转录沉默，从而保持其低水平表达状态。即使植物恢复到较高温度，FLC抑制的维持也需要染色质上的组蛋白修饰，其中起到主要作用的便是PHD-fingerprotein VERNALIZATION-INSENSITIVE 1，2，3(VIN 1，2，3)。FRIGIDA(FRI)突变体可以恢复晚花表型，且正向调控FLC的表达，同样也是春化途径中的关键基因，两者都可以抑制SOC1、LFY、FT等下游成花基因的表达。只受植物内源信号的调控，不管环境因素，生长到一定阶段后都会开花的途径统称为自主途径。拟南芥作为兼性长日照植物，在短日照下呈现晚花表型。现已被鉴定的自主途径相关基因主要有FLOWERING CONTROL LOCUSA(FCA)、FLOWERINGLOCUS PA(FPA)、FLOWERING LOCUS K(FLK)、FLOWERING LOCUS D(FLD)、FLOWERING LOCUSVE(FVE)等，拟南芥突变体fca、fld、fpa、flk均表现出晚花，且这些突变体中FLC表达量较野生型明显升高，最终导致FT和SOC1表达受到抑制而表现出晚花(Chou and Yang.1998)。但是这些基因间并不是单一的直线调控关系，它们通过各种方式独立调控FLC。但总的来说，主要通过编码两类蛋白来实现调控作用，一类是染色质加工修饰蛋白，另一类是影响RNA加工的蛋白。FVE和FKD属于前者为染色质重塑蛋白，修饰FLC染色质，造成FLC失活，同时FLD促进LFY表达，从而促进成花。而FCA、FPA和FLK基因所编码的蛋白质属于后者，抑制FLC表达属于转录后调节。不同于另外几种众所周知的途径，除了知晓细微的温度变化会对开花时间产生巨大影响外，关于温敏途径的首次分子机制研究出现的相对较晚。拟南芥在23℃的生长条件下，比16℃表现出早花表型。在对拟南芥的突变体与地理生态型研究过程中，大多数生态型在温度升高后出现早花表型，但是突变体中的SHORT VEGETATIVEPHASE(SVP)与生态型中的FLOWERINGLOCUSMFLM(FLM)缺失型都失去了温度敏感性。最近结果表明，温敏途径中的关键MADS-box家族基因SVP，它能结合成花调控整合基因FT和SOC1以及miR172启动子序列上CArG box，从而抑制成花或直接调控miR172的转录。此外，SVP还能与FLC和AP1互作，介导GA途径(抑制GA合成)来调控植物开花。FLM是FLC的高度同源基因，也同属温敏途径关键基因，外界温度会改变营养生长阶段的FLM mRNA前体的可变剪切位点，从而改变FLM表达量，调控开花。在年龄途径中，Jang et al的结果显示，最广泛的作用主体是miRNA156和miRNA172。miR156在植物童期的表达量达到顶峰，之后表达量随着植株变老而逐渐下降；而miR172的表达模式与miR156相反，随着植株变老而表达量上升，两者通过相反的平行表达模式共同调控植物成花。在植物中鉴定得到6个miR156高度保守的成员，其靶基因为SBP-box家族成员，对于拟南芥中的11个SBPs具有调控位点，可使其降解或失活。Squamosapromoter-binding-like protein(SPL)多位成员可调控植物成花，如SPL3，4，5，其上调表达可促使植物早花。而miR156可以抑制SPLs的表达，通过调控SPLs的表达而间接调控FRUITFULL(FUL)、SOC 1、LFY和APETALA1(AP1)等MADS-box基因的表达。拟南芥中miR172家族经鉴定得到5个家族成员，植株进入生殖生长的过程中，miR172调控AP2转录因子TARGETOFEAT(TOE1、2)、SCHNARCHZAPFEN(SNZ)与SCHLAFMUTZE(SMZ)，参与植物成花诱导。完全进入生殖生长后，miR172的靶基因TOE表达水平逐渐降低，这是拟南芥成花起始完成的标志，而SMZ和SNZ的过表达植株导致晚花的表型。同时miR172与miR156还具互作效应，miR172的启动子上具有可供miR156的靶基因SPL9和SPL15结合的特异区域，实现miR156对miR172的调控。而miR172则通过抑制其靶基因TOE1、2的表达反过来参与对miR156的调控。众所周知，成花诱导与许多激素相关，而GA是其中研究的较为透彻的植物内源激素，模式植物中赤霉素途径也已被确定。叶片中的赤霉素合成氧化酶Gibberellin 20 oxidase(GA20ox)上调表达导致植株GA积累，上调FT基因表达，调控植株成花。GA感受器GIBBERELLICINSENSITIVEDWARF 1GID1(GID1)通过E3泛素化修饰，由26S蛋白进行降解DELLA蛋白，从而解除对转录因子SPL的抑制作用，而激活MADS box基因如SOC1、LFY和AP1，还有miR172，从而调控开花时间。GA具有多效效应。拟南芥成花过程中，GA作用呈现出阶段性差别，开始时GA有助于抑制营养生长，启动花芽孕育，之后GA又会抑制花器官的形成(李合生2012)。而且对不同植物的成花诱导的实际作用，会因GA的种类而异。如GA₄能够促进苹果成花，而GA₃却抑制苹果成花。在成花诱导途径中，有一些重要基因，它们接收并整合各个通路的信号，将各个成花途径相互联系，相互串联起来，然后继续传递给下游基因，使其整体成为一个复杂精密的网络，从而行使多种功能。FLC整合春化途径和自主途径信号；光周期途径通过CO来调控FT基因的转录水平；温敏途径中通过SVP转录水平的变化调控下游成花基因；赤霉素途径直接向下将信号传递给SOC1。功能与SOC1相似的SVP同源基因---AGL24，可以与SOC1互作，互相提高彼此的表达水平，同时激活下游LFY的表达。LFY直接受到赤霉素途径信号调节，光周期途径CO作用于下游的FT，LFY与FT互作共同调控AP1。花分生组织决定基因LFY和AP1，一经诱导大量表达，便在茎尖不可逆转地进行花器官形态建成。糖作为植物体内重要的碳源和能源物质(Rolland et al.2005)，在成熟叶片(源器官)中经由光合作用合成，之后输送到根、茎、幼叶、花和果实等库器官中生物合成或利用。研究表明，糖分解代谢酶的较高活性可能增强芽的吸收同化物的能力，从而加速芽生长。但同时，当碳水化合物供应受到严重限制时，糖浓度应该是芽生长的限制因素。此外，富士苹果的成花诱导期间，叶片和短枝顶芽中可溶性糖水平发生显著变化，也说明糖可能作为能源物质参与调控其花芽分化过程。即使处于黑暗条件下，在地上部外施蔗糖、葡萄糖植株仍能开花，说明糖也可以参与调控花芽的生长发育。葡萄糖作为可溶性糖，对植物成花调控也十分关键。黑暗条件下的烟草组织培养，外源施加葡萄糖，植株仍能正常开花并形成正常花器官，而当外部葡萄糖浓度下降时，不形成花器官或花器官发育异常。且葡萄糖对植物成花的调控具有“两重性”，将拟南芥幼苗分别培养在浓度为2％和6％葡萄糖的条件下，不管光照条件如何改变，无论是与2％葡萄糖条件还是正常生长条件下相比，6％葡萄糖条件中的植株都延迟抽苔开花。近年来，糖信号与植物成花间的研究越来越多，其多集中于蔗糖与海藻糖。短日照条件下的拟南芥淀粉缺乏突变体pgm，未分化前外部施加蔗糖于分生组织，该突变体成花率提高2.4倍，这证明蔗糖调控植物成花的过程中除了作为能源物质还可能发挥信号作用。表明，拟南芥中蔗糖可能是信号物质，其通过T6P信号途径，实现对叶片中成花基因(主要是FT)与茎尖分生组织成花基因(主要是miR156和SPLs)的调控，从而参与成花诱导。通过对拟南芥童期转变的研究发现，随光合作用糖分的积累，葡萄糖能抑制miR156的表达，从而降低miR156对SPLs的降解作用，间接上调下游MADS-box基因的表达，促进植株脱离童期。与葡萄糖具类似作用的还有海藻糖-6-磷酸(trehalose-6-phosphate，T6P)，也能抑制miR156的表达从而促进成花转变。